鎘脅迫對芹菜生理特性及細胞超微結構的影響

徐劼 段德超

摘要：采用水培試驗，研究不同濃度鎘（Cd）脅迫下Cd在芹菜不同器官組織中的積累及對芹菜生理生化指標、細胞超微結構的影響。結果表明，Cd濃度為40 mg/L時，芹菜葉、莖、根中的Cd含量相對最高，分別為16.36、65.78、213.06 mg/L;Cd濃度為10 mg/L時，芹菜對Cd的富集和轉運能力相對最強，富集系數、轉運系數分別為5.83、0.62，同時，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量處于最高水平;Cd脅迫導致芹菜葉片細胞壁內側模糊，輪廓不飽滿，淀粉顆粒增大、變多，葉綠體出現腫脹，且基粒類囊體呈波浪狀，并處于解離狀態，而根尖細胞的細胞基質變稀，液泡數量明顯增多，細胞核仁消失，染色質外溢，線粒體出現腫脹;Cd脅迫濃度分別為5、10、20、40 mg/L時，芹菜葉組織中的可溶性蛋白含量分別為清水處理（CK）的98.73%、96.55%、91.28%、86.16%，而根中的蛋白含量分別為對照的99.74%、109.98%、132.76%、157.18%;隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜的根系活力逐漸降低，與CK相比分別顯著下降15.33%、57.72%、58.69%、70.59%（P<0.05）。

關鍵詞：芹菜;鎘;富集系數;超微結構;生理特性;轉運能力;細胞

中圖分類號： X53;S636.301? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0095-04

收稿日期：2017-12-12

基金項目：浙江省嘉興市科技計劃（編號：2017BY18065）。

作者簡介：徐 劼（1975—），男，遼寧遼陽人，博士，講師，從事土壤重金屬植物污染化學與農產品安全研究。Tel：（0573）83643295;E-mail：xujie1688@126.com。

隨著我國經濟建設發展加快，環境的重金屬污染問題日益凸顯。鎘（Cd）作為生物活性相對較高的金屬元素，移動性強、毒性大，且極易被農作物吸收，對人體健康構成潛在威脅，會產生致畸、致癌、致突變等效應[1]。Cd作為生物毒性最強的重金屬之一[2]，其引起的環境問題受到廣泛關注。

芹菜（Apium graveolens L.）作為大眾蔬菜，在我國種植較為廣泛。肖旭峰等調查發現，在重金屬污染較為嚴重的工礦、冶金、電鍍等企業或工業園區周邊，芹菜Cd污染超標現象時有發生[3]。本研究以水培芹菜為試驗材料，初步探討不同Cd濃度脅迫下芹菜各部器官對Cd的富集、吸收及生理響應，進而為芹菜對Cd脅迫的適應性研究及其抗Cd栽培實踐提供理論依據及借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的準備

津南實芹1號芹菜種子，購于河北青縣神華種子有限責任公司。對芹菜種子在溫室預先進行育苗培養，待幼苗長出6張真葉，轉移至人工氣候室進行水培，晝、夜溫度分別為25、20 ℃，相對濕度為70%～75%，光照時間為14 h。其間，先采用1/2濃度的營養液培養幼苗1周，隨后采用塑料小桶并改用全營養液培養，每桶3株，營養液配方參考文獻[4]。

1.2 試驗處理

試驗于2017年9—12月在嘉興學院環境工程實驗室內進行，芹菜幼苗在全營養液體系培養1周后，分別采用濃度為0（CK）、5、10、20、40 mg/L的硝酸鎘溶液進行Cd脅迫處理，每處理重復3次。芹菜苗培養期間，每天用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調節處理營養液的pH值為5.5左右，營養液4 d更換1次，并保持24 h通氣。Cd脅迫芹菜幼苗培養 14 d，將植株用自來水沖洗以去除根表吸附的Cd及其他離子，用25 mmol/L Na2-EDTA溶液浸泡根系15 min[5];用去離子水將幼苗沖洗干凈，用吸水紙吸干水分;部分根、葉樣品用于透射電鏡樣品制備，部分根、莖、葉置于-70 ℃冰箱貯藏，備用。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 鎘含量 稱取根、莖、葉鮮樣各0.500 g分別置于 150 mL 三角瓶中，HNO3-HCl-HClO4法消煮完全;1% HCl定容，用美國戴安公司產ICS-2000型電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-AES）測定Cd含量，單位為mg/kg，其中，1 000 mg/L Cd標準液，購于國家環境保護部標準樣品研究所，標準參比物質為GBW（E）090066;計算芹菜對Cd的轉運系數、富集系數，公式分別為

轉運系數=幼苗地上部Cd含量/根Cd含量;

富集系數=地上部Cd含量/處理溶液Cd含量[6]。

1.3.2 生理特性 葉綠素含量參照乙醇-丙酮提取法[7]測定;葉片、根的可溶性蛋白含量參照考馬斯亮藍法[8]測定;根系活力參照氯化三苯基四氮唑（TTC）還原法[9]測定，并計算TTC還原產物三苯基甲腙（TTF）的量，評價植物根系活力[10]。

1.3.3 透射電鏡（SEM）觀察 本觀察在浙江大學農生環測試中心完成。取10 mg/L Cd脅迫處理14 d的芹菜根、葉樣品，參照徐劼的方法[11]對芹菜不同器官組織進行前處理及制備：利用切片機將根、葉樣品切成80 nm的薄片，切片經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，采用HITACHI H7650型透射電鏡進行超微結構觀察并拍照。

1.4 數據分析

采用Excel 2010軟件對試驗數據進行統計整理，采用SPSS 17.0軟件對各處理進行最小顯著差異法（LSD）差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 芹菜對鎘的富集、轉運情況

由表1可知，隨Cd脅迫濃度的增加，芹菜葉、莖、根中的Cd含量呈逐漸上升趨勢;同一濃度Cd脅迫下，芹菜各器官組織中的Cd含量由低到高依次為葉<莖<根，根對Cd的富集能力相對較強;Cd脅迫濃度為40 mg/L，葉、莖、根中的Cd含量相對最高，分別為16.36、65.78、213.06 mg/kg，顯著高于其他處理（P<0.05）;Cd脅迫濃度為10 mg/L時，芹菜對Cd的富集、轉運系數相對最大，分別為5.83、0.62。

2.2 Cd脅迫下芹菜葉、根細胞的超微結構變化

2.2.1 葉細胞超微結構變化 由圖1可見，0 mg/L Cd脅迫處理（CK）的芹菜幼苗，其葉細胞中細胞壁與細胞質膜相互緊貼，細胞核完整，核仁清晰可見，核內染色質分布均勻，葉綠體為長梭形，雙層被膜結構清晰，且葉綠體中含有一定數量的嗜鋨顆粒及較小體積尺寸的淀粉顆粒，葉綠體基質片層結構層次清晰、排列規整;10 mg/L Cd脅迫處理的芹菜葉片細胞超微結構發生較大變化，細胞壁內側模糊，輪廓不飽滿，葉綠體腫脹變形，內部基粒片層結構松散，基粒類囊體疏松呈波浪狀排列，葉綠體中淀粉顆粒體積尺寸變大。

2.2.2 根細胞超微結構變化 由圖2可見，0 mg/L Cd脅迫處理（CK）的芹菜幼苗根尖組織細胞結構正常，細胞核質界限分明，細胞核結構完整，核仁完整，細胞核內染色質呈均勻分布;10 mg/L Cd脅迫處理的芹菜根組織細胞超微結構產生毒害，根細胞中液泡數量明顯增多，細胞核仁消失，核內染色質外溢，胞內線粒體脊突膨脹。

2.3 Cd脅迫對芹菜生理特性的影響

2.3.1 葉綠素含量 由表2可見，10 mg/L Cd脅迫處理時，芹菜葉片葉綠素a、葉綠素b及其總量相對最高，分別為 1.867、0.656、2.523 mg/g，后隨Cd脅迫濃度的增加呈下降趨勢;隨Cd脅迫濃度的增大，葉綠素a與葉綠素b比值呈先降低后上升趨勢，這與葉綠素a、葉綠素b含量的變化趨勢相反;不同濃度Cd脅迫處理下，芹菜葉片葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量相互間差異顯著（P<0.05）。

2.3.2 根、葉中可溶性蛋白含量 可溶性蛋白含量變化可間接反映Cd脅迫對芹菜組織中蛋白質合成、降解或變性等過

程的影響。由圖3可見，隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜葉中的可溶性蛋白含量逐漸減少， 而根中的可溶性蛋白含量正好相反，呈增加趨勢;Cd脅迫濃度為5、10、20、40 mg/L時，芹菜葉、根組織中的可溶性蛋白含量分別為各自對照的98.73%、96.55%、91.28%、86.16%和99.74%、109.98%、132.76%、157.18%;Cd脅迫濃度為5 mg/L時，芹菜葉、根組織中的可溶性蛋白含量與對照處理差異不顯著（P>0.05），當Cd脅迫濃度≥10 mg/L時，各處理相互間差異顯著（P<0.05）。

2.3.3 根系活力 植物對各種元素的吸收主要借助根系，根系的發育狀況對地上部生長代謝活動存在重要的影響。由圖4可知，隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜根系活力呈逐漸降低趨勢;Cd脅迫濃度為5、10、20、40 mg/L時，芹菜根系活力分別較CK下降15.33%、57.72%、58.69%、70.59%，說明高濃度Cd脅迫對芹菜根的影響顯著（P<0.05），產生一定的毒害作用。

3 結論與討論

重金屬進入植物體內，通過在植物根部富集可一定程度上限制其向地上部遷移，進而提高植物對重金屬的耐性。重金屬在植物根系組織中的大量累積是源于其透過根表進入皮層組織細胞，與皮層細胞中的核酸、多糖、多肽、蛋白質等化合物絡合而形成各種穩定的、不溶大分子物質[12]。本研究結果表明，同一鎘（Cd）濃度脅迫下，芹菜不同器官中的Cd含量由高到低分布為根>莖>葉，根中的Cd含量相對最高，與鄒金華等的研究結果[13-16]相似，而Cd在芹菜根系內的過量累積可適當減少其對地上部器官組織的傷害，這是芹菜一定條件下自我保護的一種耐受方式;隨Cd脅迫濃度的增加，芹菜葉、莖、根中的Cd含量提高，Cd脅迫濃度為40 mg/L，芹菜葉、莖、根中的Cd含量相對最高，分別為16.36、65.78、213.06 mg/kg，顯著高于其他處理（P<0.05），說明高濃度的Cd脅迫可能對芹菜根系質膜產生較大毒害作用，由于膜透性增強使得根系吸收的Cd更容易向地上部轉運。

組織細胞超微結構的改變會對植物的生理活動產生一定負面影響[17]。Nash等研究發現，在重金屬脅迫下，植物器官組織細胞中的線粒體、細胞核、細胞膜及多核糖體等細胞器最先顯現受毒害癥狀[18]。植物光合作用功能的發揮主要由葉綠體結構承擔完成，葉綠體結構的正常與否對光合作用的影響至關重要[19]。正常環境下，葉細胞葉綠體結構中的類囊體垛疊緊密，并能保持葉綠體膜電荷的穩定，進行更加有效的光能傳遞[20]，而此時胞內超氧化物自由基的產生和消除也能維持在動態平衡水平[21]。有研究認為，葉綠體由正常的紡錘形結構轉成橢球或圓球形，一方面是由于重金屬的脅迫作用導致滲透壓的改變，另一方面重金屬脅迫也會造成葉細胞中過量H2O2的蓄積，最終通過Haber-Weiss反應產生氧化能力超強的羥基自由基，從而造成膜脂過氧化過程的發生并破壞膜蛋白，引起膜結構的改變[22]。線粒體是植物細胞代謝的能量中轉站，含有多種參與能量轉換的酶類物質。細胞的發育生長及胞內蛋白質的合成受控于細胞核[23]，進入植物組織細胞的重金屬會與細胞核內的大分子物質如核酸發生結合作用，而造成染色體的畸變或斷裂[24]，最終導致細胞消亡。侯江濤等研究認為，脅迫環境下，植物組織細胞中液泡增大可有利于吸收其他細胞器解體后所釋放出的有毒物質，從而可適當減輕這些有毒物質對細胞結構及代謝途徑的破壞作用[25]。本研究結果表明，Cd脅迫造成芹菜葉細胞中葉綠體結構的改變，芹菜葉片細胞細胞壁內側模糊，輪廓不飽滿，淀粉顆粒增大變多，葉綠體被膜破損，類囊體出現空泡化現象，Cd脅迫引起葉綠體光合功能喪失;芹菜不同器官組織細胞中的線粒體脊突出現膨脹或部分消失、溶解，線粒體正常的呼吸作用和糖代謝功能受到干擾;Cd脅迫導致根尖組織細胞中細胞基質變稀，液泡數量明顯增多，細胞器組織結構遭受一定程度破壞，細胞核仁消失，染色質外溢，線粒體出現腫脹。

葉綠素含量高低可反映植物光合作用的水平，其中，葉綠素a發揮捕獲光能和原初反應的作用，葉綠素b傳遞光能[26]。重金屬脅迫會導致葉細胞中葉綠素含量的下降，進而使植物出現葉片失綠現象，而植物受重金屬毒害的作用程度，一定范圍內可用葉綠素含量的變化間接評判[27]。本研究發現，10 mg/L Cd脅迫處理時，芹菜葉片葉綠素a、葉綠素b及其總量相對最高，分別為1.867、0.656、2.523 mg/g，后隨Cd脅迫濃度的增加呈下降趨勢，而造成葉綠素含量下降的原因可能是Cd與葉綠體中膽色素原脫氨酶、原葉綠素脂還原酶、δ- 氨基乙酰丙酸合成酶等多種酶的巰基結合，使得葉綠體功能和結構受到影響，從而使葉綠素分解[28]，可能是Cd脅迫引起葉細胞內膜結構破壞，從而導致葉綠素的含量下降[29]，也有可能是Cd影響植物葉片組織對Fe、Mn元素的吸收，從而導致葉綠素含量和對CO2吸收量的減少，進而影響葉綠素合成[28-30]。

植物組織內的可溶性蛋白大多為參與各種代謝的酶類組分，其含量高低反映體內細胞總代謝水平能力的大小[31]，從某種意義可體現逆境生長環境下植物生長能力的強弱[32]，而重金屬脅迫造成植物組織中可溶性蛋白含量的變化主要是由于重金屬會影響蛋白酶的水解活性。同時，可溶性蛋白含量的增加，還意味著細胞滲透物質濃度的提高及相關功能蛋白數量的增多，反過來會對細胞正常的代謝活動產生一定的促進作用[33]。本研究發現，隨Cd脅迫濃度增大，芹菜根組織中的可溶性蛋白含量增加，這說明在Cd脅迫下，芹菜根組織可通過某些生理生化轉化過程誘導產生類金屬鰲合蛋白、金屬硫蛋白、脅迫蛋白等鎘結合蛋白，防止Cd敏感酶變性失活，從而弱化Cd的毒性作用，進而提高植株對Cd脅迫的適應能力[34];相對于根系而言，芹菜葉片對Cd的脅迫作用較為敏感，較低濃度的Cd脅迫也會造成葉片組織中活性氧自由基增多，造成葉細胞的過氧化損傷，導致合成蛋白質的酶活性受抑制，進而影響某些可溶性蛋白的合成而導致蛋白含量降低，這可能是因為Cd脅迫作用能誘導植物組織中的蛋白快速分解[35]，而葉綠體中的蛋白質含量占到葉片中蛋白質總量的70%，Cd脅迫會造成葉綠體超微結構的損傷，進而使得蛋白含量水平隨Cd處理濃度的增大而不斷降低[33]。

植物根系活力可以表征根系代謝活動過程中的吸收、合成、氧化及還原能力[36]。本研究結果表明，隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜根系活力不斷下降，說明Cd脅迫對芹菜根系產生一定的毒性作用，從而導致根系吸收水分、養分的能力減弱。

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