膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累規(guī)律研究

呂爽 包蕊 劉俊頻 袁元 全雪麗 吳松權(quán)

摘要：為了解膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累規(guī)律，為膜莢黃芪的種植和采收提供理論依據(jù)，測(cè)定了自然環(huán)境條件下膜莢黃芪生長(zhǎng)中的生物量，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，土壤溫度和濕度，并分析了毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累變化規(guī)律。總體而言，隨著生物量的增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在葉中呈下降趨勢(shì)，在莖中呈上升趨勢(shì)，而在根中表現(xiàn)出先下降再上升的趨勢(shì)、且與土壤溫度和水分呈顯著負(fù)相關(guān)，病蟲(chóng)害的發(fā)生則明顯降低了生物量和毛蕊異黃酮苷的積累。研究得出的結(jié)論是膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累具有組織特異性，其在地上部和地下部的含量受不同機(jī)制的調(diào)控，適當(dāng)?shù)牡蜏睾退置{迫有利于根中毛蕊異黃酮糖苷的積累。

關(guān)鍵詞：膜莢黃芪;毛蕊異黃酮葡萄糖苷;積累規(guī)律;病蟲(chóng)害

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.23+9.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）05-0103-03

收稿日期：2018-06-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21462044、30860036）。

作者簡(jiǎn)介：呂 爽（1993—），女，吉林松原人，碩士研究生，研究方向?yàn)樘胤N植物資源。E-mail：893226771@qq.com。

通信作者：全雪麗，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘胤N植物資源，E-mail：qxl2000@aliyun.com;吳松權(quán)，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘胤N植物資源，E-mail：arswsq@ybu.edu.cn。

黃芪為豆科（Leguminosae）植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.]的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、脫毒排膿的功效[1]。黃芪含有多種化學(xué)成分，主要有皂苷類(lèi)、多糖類(lèi)和異黃酮類(lèi)等[2-3]。其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中主要的異黃酮類(lèi)活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、清除超氧陰離子、保護(hù)肝細(xì)胞、增加缺血再灌注大鼠腦細(xì)胞中膜的流動(dòng)性[4]、預(yù)防骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)骨質(zhì)再生等作用[5]，并且對(duì)糖尿病腎病的發(fā)展也具有潛在的調(diào)控作用[6]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷是評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量的“標(biāo)記化合物”之一[1]。目前，普遍采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC）來(lái)檢測(cè)黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，此法具有準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)[1，7-8]。

黃芪是名貴中藥材，由于長(zhǎng)期大量采挖導(dǎo)致野生資源急劇減少，野生黃芪已被列為國(guó)家3級(jí)保護(hù)植物[9]。膜莢黃芪主產(chǎn)于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、河北、山西等地[3]。《藥物出產(chǎn)辨》（1920年）記載：“正芪產(chǎn)區(qū)有3處：1關(guān)東，2寧古塔，3卜奎”，其中寧古塔為黑龍江省寧安和吉林省延吉一帶（延邊朝鮮族自治州，即延邊地區(qū)）。但在延邊地區(qū)這一優(yōu)質(zhì)的道地藥材由于野生資源被過(guò)度利用而不能滿(mǎn)足人們的需求，且人工栽培黃芪還不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的野生黃芪[10]。延邊地區(qū)位于吉林省長(zhǎng)白山麓，屬中溫帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，春季干燥多風(fēng)，夏季溫?zé)岫嘤辏锛緵鏊儆辏竞渎L(zhǎng)。由于其獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件，形成了復(fù)雜的植被類(lèi)型和豐富的野生植物資源，特別適合發(fā)展中草藥產(chǎn)業(yè)[11-12]。本研究的目的是以膜莢黃芪為植物材料，研究自然生長(zhǎng)條件下根、莖和葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累規(guī)律，為延邊地區(qū)膜莢黃芪栽培和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

黃芪種子和植株采自吉林省延吉市，經(jīng)延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室石鐵源教授鑒定為膜莢黃芪。憑證標(biāo)本留存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室。

1.2 試劑和主要儀器

對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：110907）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%;色譜級(jí)乙腈購(gòu)于美國(guó)Fisher公司;色譜級(jí)甲醇購(gòu)于美國(guó)邁瑞達(dá)科技有限公司;水為超純水;其他試劑均為分析純。

島津高效液相色譜儀（LC-10ATVP Plus），包括二元高壓梯度泵（LC-10ADVP）、紫外可見(jiàn)雙波長(zhǎng)檢測(cè)器（SPD-10AVP Plus）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-10A）、柱溫箱（CTO-10ASVP Plus）;C18反向色譜柱（華譜科儀科技有限公司）;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）;RE-501型恒溫水浴鍋（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）;KQ-500D型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超速儀器有限公司）;精密鼓風(fēng)干燥箱（上海施都凱儀器設(shè)備有限公司）;RHP-600型高速多功能粉碎機(jī)（浙江榮浩工貿(mào)有限公司）;土壤溫濕度測(cè)定儀（順科達(dá)）。

1.3 方法

1.3.1 黃芪種植和采收 于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地（吉林省延吉市）進(jìn)行。2015年4月10日播種，6月10日后現(xiàn)真葉，10月枯萎;越冬后，次年4月下旬開(kāi)始返青，10月枯萎。由此確定1年生采收期從7月開(kāi)始，2、3年生采收期從5月開(kāi)始，截止至10月，具體采樣日期為每月10日。每次采樣時(shí)取9株植株，3株植株為1次重復(fù)。采樣后，將樣品于50 ℃烘干箱中烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定生物量。將干燥樣品磨至粉末狀，過(guò)60目篩，用于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取。

1.3.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測(cè)定

1.3..2.1 供試品溶液 參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》方法[1]。精確稱(chēng)取黃芪樣品粉末0.5 g，放入圓底燒瓶中，加入分析級(jí)甲醇50 mL，于80 ℃水浴鍋中加熱回流4 h，冷卻至室溫，用沃特曼（Whatman）中速濾紙過(guò)濾后，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用5 mL色譜級(jí)甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，密封保存，待HPLC分析。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3..2.2 HPLC分析 采用Kim等的方法[13-14]。利用反向C18色譜柱（5 μm，100A，4.6 mm×250 mm）進(jìn)行試驗(yàn)，流動(dòng)相A為水，B為乙腈;流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為 230 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。二元梯度洗脫條件：B泵濃度在0～30 min為15%～55%，30～35 min為55%～100%，35～40 min為100%～15%，40～45 min為15%。

1.3.2.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷產(chǎn)量 毛蕊異黃酮葡萄糖苷產(chǎn)量=毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量×生物量。

1.4 土壤溫度和濕度

用土壤溫濕度測(cè)定儀測(cè)定，探針深度為10 cm，取月平均值代表土壤溫度和濕度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件包，2個(gè)樣本之間顯著性差異利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（P<0.05），相關(guān)性分析利用雙變量相關(guān)分析中的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，簡(jiǎn)稱(chēng)Pearson）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)時(shí)期膜莢黃芪的生物量

在本研究過(guò)程中，隨著膜莢黃芪的自然生長(zhǎng)，1、2年生黃芪幾乎沒(méi)有發(fā)生病蟲(chóng)害，而3年生黃芪在5月末受到蚜蟲(chóng)侵害，6月初發(fā)生白粉病，8月初開(kāi)始受根腐病危害，其生物量的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。隨著植株生長(zhǎng)，根生物量呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，1、2年生積累速度較快，3年生積累速度開(kāi)始減緩，這可能與3年生黃芪發(fā)生病蟲(chóng)害有關(guān);1、2年生莖生物量至9月份為止呈上升趨勢(shì)，10月份地上部開(kāi)始枯萎時(shí)出現(xiàn)下降現(xiàn)象，而3年生莖生物量至9月份為止呈波動(dòng)升高，隨后降低;1、2年生葉生物量積累與莖相似，3年生葉生物量則在6月份明顯增加后，一直呈降低趨勢(shì)。2、3年生莖和葉的生物量在6月份快速積累，表明植株開(kāi)始進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期。總體而言，1、2年生黃芪的生物量隨著植株生長(zhǎng)逐漸積累，而病蟲(chóng)害的發(fā)生嚴(yán)重限制了3年生黃芪生物量的積累。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

毛蕊異黃酮葡萄糖苷在膜莢黃芪自然生長(zhǎng)中的各個(gè)時(shí)期、各個(gè)部位（根、莖和葉）均有分布（圖2）。其含量在1年生根中呈增長(zhǎng)趨勢(shì)（7—10月），在2年生根中呈先降低（5—7月）后升高（8—10月）趨勢(shì)，在3年生根中除8月明顯增加之外，變化趨勢(shì)與2年生相似，這可能與3年生根在8月受根腐病刺激有關(guān);1、2年生莖中含量一直保持上升趨勢(shì)，3年生莖中含量到8月為止也一直呈上升趨勢(shì)，之后開(kāi)始下降;1、2年生葉中含量呈持續(xù)下降趨勢(shì)，3年生葉中除6月急劇增加之外，也一直保持下降趨勢(shì)。總而言之，1、2年生黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累規(guī)律相似，而病蟲(chóng)害的發(fā)生干擾了3年生黃芪中較為規(guī)律的積累模式。

2.3 土壤溫度和濕度對(duì)根毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響

由于3年生黃芪受病蟲(chóng)危害，本研究只分析了土壤溫度和濕度對(duì)1、2年生黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響。由圖3可知，黃芪土壤溫度和濕度變化趨勢(shì)與根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量變化趨勢(shì)（圖2）相反。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，土壤溫度和濕度與1年生根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.974（P<0.05）和 -0.988（P<0.05），與2年生根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.952（P<0.01）和 -0.931（P<0.01），這表明土壤溫度和濕度與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.4 毛蕊異黃酮的葡萄糖苷產(chǎn)量

由圖4可見(jiàn)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷總產(chǎn)量（包括根、莖和葉）在1、2年生黃芪中整體呈上升趨勢(shì)，10月時(shí)最高，而病蟲(chóng)害的發(fā)生則抑制了3年生黃芪總產(chǎn)量增長(zhǎng)。值得一提的是，除5月外，2年生莖中的產(chǎn)量明顯高于同時(shí)期根和葉中的產(chǎn)量。

3 討論

毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中主要的活性成分之一，由本研究結(jié)果可知，其組成型表達(dá)發(fā)生在膜莢黃芪生長(zhǎng)的各個(gè)部位和各個(gè)時(shí)期， 這表明它在膜莢黃芪的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要的作用。在不發(fā)生病蟲(chóng)害時(shí)，無(wú)論是1年生還是2年生黃芪，隨著植株的生長(zhǎng)和生物量的積累，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在莖中呈上升趨勢(shì)，在葉中則保持下降趨勢(shì)，說(shuō)明地上部毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量受植物本身生長(zhǎng)發(fā)育水平的調(diào)控，

在嫩葉和成熟莖中含量較高。特別是2年生成熟莖（8、9、10月）中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[1]（>0.02%，即>200 μg/g），產(chǎn)量高，可成為獲取毛蕊異黃酮葡萄糖苷的有效途徑。

根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量與土壤溫度和濕度呈顯著負(fù)相關(guān)，且地上部枯萎后，土壤中的根經(jīng)過(guò)寒冷漫長(zhǎng)的冬季和寒冷干燥的春季，其毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量（2、3年生5月）與上一年（1、2年生10月）相比明顯增加。這些結(jié)果表明，根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的積累與黃酮類(lèi)化合物在植物的抗寒和抗旱過(guò)程中的保護(hù)作用密切相關(guān)[15]，即適當(dāng)?shù)牡蜏睾退置{迫促進(jìn)了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累。Pan等也報(bào)道，低溫（2 ℃）刺激了蒙古黃芪幼苗根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累[7]，并且這種積累提高了蒙古黃芪幼苗的耐凍性[16]。還有報(bào)道表明，適當(dāng)?shù)母珊得{迫促進(jìn)了3年生蒙古黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累[17]。

在黃芪植株生長(zhǎng)過(guò)程中，病蟲(chóng)害的發(fā)生是不可避免的。由本研究結(jié)果可知，進(jìn)入快速生長(zhǎng)期之后，病蟲(chóng)害的發(fā)生嚴(yán)重限制了3年生黃芪生物量的積累，這與楊春清等報(bào)道的黃芪白粉病、根腐病和蚜蟲(chóng)等病蟲(chóng)害的發(fā)生會(huì)造成黃芪大幅度減產(chǎn)的結(jié)果[18]相一致。異黃酮是豆科植物中的植保素[19]，異黃酮的含量與大豆抗蚜蟲(chóng)[20]、紅三葉抗白粉病[21]和大豆抗根腐病[19]的能力密切相關(guān)。與此相似，在本研究中蚜蟲(chóng)與白粉病（6月的葉）、根腐病的發(fā)生之初（8月的根）分別誘導(dǎo)了黃芪葉和根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的明顯積累，但是長(zhǎng)期的病蟲(chóng)危害則降低了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量和產(chǎn)量。

根是黃芪主要的入藥部位，在本試驗(yàn)中，根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累是動(dòng)態(tài)的，與非生物和生物脅迫密切相關(guān)，同時(shí)也具有時(shí)間特異性，這可能與膜莢黃芪長(zhǎng)期適應(yīng)延邊地區(qū)的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。因此，在比較不同地區(qū)膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量時(shí)，應(yīng)充分了解各自地區(qū)毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累的差異性，以增加可比性。

綜上，本試驗(yàn)結(jié)果表明，2年生膜莢黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行適時(shí)采收;成熟莖中含量和產(chǎn)量都較高，可用于開(kāi)發(fā)飼料;嫩葉中含量也不低，適合作茶飲，這些結(jié)果將有助于指導(dǎo)延邊地區(qū)黃芪的栽培和生產(chǎn)。

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