硝酸銅對白木香細胞生長及抗氧化酶活性的影響

張梓豪 李明 鄭揚波 吳燕燕

摘要：通過在白木香細胞液體培養基中添加外源硝酸銅[Cu（NO3）2]與其共培養的方法，檢測白木香細胞的生長情況、細胞活力、銅離子（Cu2+）含量、丙二醛 （MDA） 含量、過氧化氫 （H2O2） 含量以及超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶 （CAT） 和過氧化物酶 （POD） 活性。結果表明，在50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香共培養24 h，白木香的細胞活力較對照呈顯著下降，隨處理濃度的增加而顯著降低。培養至72 h，隨著Cu（NO3）2濃度的增加，其細胞鮮質量、干質量均較對照呈顯著降低的變化。在檢測的時間內，Cu（NO3）2處理組白木香細胞的Cu2+含量、H2O2含量、MDA含量均較對照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高，Cu（NO3）2處理組細胞的SOD、CAT、POD活性均隨Cu（NO3）2濃度的增加而較對照顯著升高。可以看出，一定濃度的外源硝酸銅能夠抑制白木香細胞生長和降低其活力，并導致白木香細胞發生氧化脅迫。

關鍵詞：硝酸銅;白木香細胞;細胞活力;抗氧化酶

中圖分類號：S718.43? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0106-04

收稿日期：2018-07-03

基金項目：廣東省科技計劃（編號：2013B020503066、2014A020208133、2016A020226050）。

作者簡介：張梓豪（1993—），男，廣東佛山人，碩士研究生，主要從事中藥資源與質量研究。E-mail：1092292441@qq.com。

通信作者：李 明，博士，教授，主要從事中藥資源及品質評價研究。E-mail：13539843803@163.com。

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]是瑞香科植物，其木質部在受到外界環境脅迫（機械損傷、化學刺激、病蟲害侵染等）后會產生和積累次生產物，即結香[1]。白木香結香是其在受到環境脅迫的條件下，體內的自我防御的生理生化響應過程。近年來，張爭等提出了“白木香防御反應結香假說”[2]，認為物理損傷，化學、真菌誘導子侵染等外界刺激能夠誘導白木香發生防御反應，并誘導產生次生產物的積累。

銅是一種高等植物生長發育過程中必需的重要微量營養元素，對植物的生長發育、品質及產量等有重要影響，對于藥用植物的次生產物積累也有一定的影響[3]。研究表明，在一定濃度的銅刺激植物后，植物體內的活性氧（ROS）得到積累，并激發了細胞的自身防御系統清除過量積累的ROS，表現出抗氧化酶活性的升高，而過高濃度的銅能夠使植物體內的活性氧大量積累，并且超出細胞自身的抵御能力，對細胞的結構和功能造成了嚴重的破壞，造成抗氧化酶系統嚴重失衡。

本試驗研究了外源銅離子對白木香細胞的生長、活力及抗氧化酶活性的影響，為研究銅離子對白木香細胞的影響，以及今后可能在白木香結香中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1 白木香細胞的培養 參考董閃等的方法[4]，培育白木香愈傷組織。挑取培養14 d的愈傷組織，接種至40 mL的1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L液體培養基中，置于（25±1） ℃的恒溫搖床上，在光照時間為12 h/d、轉速為130 r/min的條件下培養。本試驗在廣東藥科大學（23°20′N，113°30′E;年降雨量為1 623.6～1 899.8 mm;海拔為18 m;溫度為24～32 ℃）中藥樓進行。

1.1.2 硝酸銅處理 將過濾0.45 μm濾膜的不同濃度硝酸銅溶液加入到白木香細胞培養液中共培養，定期每天09：00取樣檢測各項指標。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 細胞鮮質量和干質量的測定 參照孫盈盈的試驗方法[5]略加修改。每24 h取出經硝酸銅溶液處理的白木香細胞，采用稱質量法測定細胞的鮮質量;置于80 ℃烘箱烘約 12 h 至恒質量，稱量細胞干質量。每個處理重復3次。

1.2.2 細胞活力測定 參考Mikula等的方法[6]，采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法分別進行細胞活力檢測。

1.2.3 細胞內銅離子（Cu2+）含量測定 參考《中國藥典》2015版[1]，采用硝酸-高氯酸（4 ∶ 1）法進行消解。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量測定 提取液制備和含量測定參照李合生的方法[7]，并略作改進。

1.2.5 過氧化氫（H2O2）含量測定 提取液制備和含量的測定參照饒力群等的方法[8-9]，并略作改進。

1.2.6 過氧化物酶液制備及其活性測定 超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）酶液的制備和活性測定參照張志良等的方法[10]。

1.3 數據分析

采用Excel 2013和SPSS 19.0統計軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Cu（NO3）2對白木香細胞生長的影響

試驗結果表明，白木香細胞在與不同濃度的銅離子共培養 72 h 起，隨著Cu（NO3）2濃度的增加，其細胞鮮質量、干質量均較對照呈顯著降低的變化（P<0.05）。培養至96 h時，50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2處理的白木香細胞鮮質量、干質量分別較對照降低了22.97%、42.42%、49.98%和1365%、2642%、33.17%（圖1、圖2）。

2.2 Cu（NO3）2對白木香細胞活力的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香共培養24 h后，白木香的細胞活力隨Cu（NO3）2濃度的增加呈顯著降低的變化（P<0.05）。培養72 h時，50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2 處理的細胞活力較對照組分別降低了72.98%、8586%、9166%（圖3）。

2.3 Cu（NO3）2對白木香細胞Cu2+含量的影響

由表1可見，用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細胞共培養，在檢測的時間內，細胞的Cu2+含量均較對照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。在培養72 h時細胞Cu2+含量分別較對照組升高了9.78%、54.29%和60690%（P<0.05）。

2.4 Cu（NO3）2對白木香細胞MDA含量的影響

由圖4可知，用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細胞共培養，在檢測6～72 h，細胞的MDA含量均較對照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。在培養72 h時細胞MDA含量分別較對照組升高了65.98%、118.89%、181.69%

2.5 Cu（NO3）2對白木香細胞過氧化氫含量的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細胞共培養，在檢測的12-72 h，白木香細胞的H2O2含量均較對照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。在培養72 h時，細胞內H2O2含量分別較對照組升高了33.59%、56.84%、 7569%（P<0.05）（圖5）。

2.6 Cu（NO3）2對白木香細胞SOD活性的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細胞共培養，在培養6～72 h時，細胞的SOD活性均隨Cu（NO3）2濃度的增加而較對照顯著升高。在培養24 h時，各處理的細胞SOD活性最強，50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2處理的細胞SOD活性分別比對照升高了171.16%、187.74%、260.30% （P<005），隨后各濃度的處理均呈降低的變化，但均顯著高于對照（圖6）。

2.7 Cu（NO3）2對白木香細胞CAT活性的影響

用50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細胞共培養，在檢測的6～72 h，細胞的CAT活性均較對照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高，在培養24 h時，CAT活性達到最高，分別較對照升高了22.37%、83.00%、96.33% （P<005），隨后各濃度的處理均呈降低的變化，但均顯著高于對照（圖7）。

2.8 Cu（NO3）2對白木香細胞POD活性的影響

50、100、200 μmol/L Cu（NO3）2與白木香細胞共培養 6～72 h，細胞的POD活性均較對照有顯著升高的變化，且隨濃度的升高而升高。各處理在培養48 h時，POD活性達到最高值，分別比對照升高了131.76%、182.46%、202.54%（P<005），隨后呈降低的變化，但均顯著高于對照（圖8）。

3 討論

銅離子不僅是許多酶（包括參與呼吸的細胞色素C氧化酶、參與活性氧清除以及引起酚類物質氧化褐變、促進次生代謝、產生防御反應的多酚氧化酶等）的輔基[11-12]，而且是植物體內生長發育所需的微量營養元素，植物如缺乏銅離子會導致其葉綠素的缺失、光合作用受阻[8]、根系活力的下降[13]等。但外源如土壤中的銅離子過量則會脅迫植物產生活性氧，并且會打破其清除機制的動態平衡，造成氧化傷害[14]。廖建良等研究表明，銅離子濃度超過10 mg/L時，金針菇的生長受到抑制，且部分細胞的有絲分裂出現異常[15]。王蕊等對豌豆苗的研究發現，100mg/L銅離子會抑制其幼苗根生長、芽長的伸長，且導致其體內SOD、POD、CAT等活性的下降，MDA含量升高[16]。

本研究表明，在不同銅離子濃度脅迫下，白木香懸浮細胞生長受到不同程度的影響。在培養24 h時，細胞活力呈現明顯下降，處理組細胞活力較對照組降幅都達50%以上，且其細胞活力隨處理時間的增加而下降，在同一處理時間，細胞活力隨外源銅離子濃度增加顯著降低。細胞鮮質量、干質量在培養48 h時，隨處理濃度的增加在一定范圍內顯著下降，在培養72 h時，下降幅度最大。

藥用植物體內銅離子濃度標準不能超過20 mg/kg[17]。本研究表明，細胞內銅離子含量隨著外源銅離子濃度增加而升高，在硝酸銅誘導細胞的12 h時，檢測到50、100 μmol/L濃度處理組的細胞內銅含量分別為9.45、1549 mg/kg，在高銅脅迫72 h下的白木香懸浮細胞內的銅離子含量顯著增加，較對照組升高了606.90%，說明外源銅濃度的增加與細胞內銅離子含量的增加呈正相關。

H2O2是一種廣泛存在于植物體內各種代謝途徑中的活性氧，同時也是植物體內普遍存在的一類重要的防御氧化反應相關的信號分子[18-19]。MDA是用于表達膜質過氧化程度的指標，其值越高，表示膜質過氧化程度越高，細胞損傷越嚴重[20]。通過對白木香細胞中MDA含量的檢測發現，隨著銅離子濃度的升高，白木香懸浮細胞內的MDA含量、H2O2含量也顯著升高，推測白木香細胞在脅迫下，細胞膜脂發生了氧化脅迫反應。植物自身體內具有清除活性氧的體系，主要由SOD、CAT、POD等酶組成。SOD是抗氧化防御中的一個關鍵酶，用于清除體內的超氧陰離子自由基（ O-2 ·? ），降低在脅迫作用下細胞膜受到的損害。CAT、POD 2種酶具有類似的功能，主要是清除體內過量的H2O2活性氧，降低ROS（活性氧）的濃度[21-23]。本研究顯示，白木香細胞在50、100、200 μmol/L濃度的外源銅離子脅迫下，其體內POD、SOD、CAT活性隨處理時間的延長呈先升后降的變化趨勢，且在同一檢測時間內，其活性均隨著硝酸銅濃度的升高而升高，其中，在誘導的24 h時，CAT、SOD活性達到最高值，在48 h時，SOD、CAT活性出現下降的情況，表明細胞內的保護酶系統可能受到破壞，2種酶的作用下降，無法清除體內過量的ROS。POD活性隨濃度的升高而升高，至48 h時達到高峰，隨后下降。這些結果與已報道的部分研究結果相似[24-25]。

本研究表明，在較高濃度的外源銅離子影響下，白木香細胞體內發生氧化脅迫反應，細胞生長受到一定程度的抑制，細胞H2O2含量增加，MDA含量升高，細胞抗氧化酶活性升高。外源銅離子作為一種誘導子，可誘導白木香細胞抗氧化酶活性等指標產生變化，在細胞體內銅離子濃度最低標準前提下，如何利用外源銅離子誘導白木香細胞次生產物和有效成分的產生和積累，有待進一步的研究。

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