總固體濃度對豬糞厭氧消化的影響及菌群結構分析

王樂樂 鄭訊濤 張寓涵 劉晗曉 潘云霞

摘要：厭氧發酵是解決畜禽糞污染的重要途徑。為降低豬糞對環境的污染，研究總固體（total solid，簡稱TS）濃度對固液分離后的豬糞厭氧消化性能的影響，并對適宜TS濃度豬糞發酵液的微生物菌群結構進行分析。結果表明，固液分離后的豬糞在TS濃度為7%、10%、13%、16%的濕發酵、半干發酵和干發酵中，揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，簡稱VFAs）以乙酸和丙酸為主，并有少量丁酸和微量的甲酸。TS濃度為13%的豬糞，乙酸平均含量占VFAs平均含量的比例最高，達35.14%，累積TS產氣量和日均產氣量分別為 370.90 mL/g 和3.02 mL/g，高于其他各組。厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）是TS濃度為13%的豬糞厭氧發酵優勢細菌菌群，它們的相對豐度分別為29.5%、28.9%和25.5%;甲烷球菌目（Methanosarcinales）、甲烷鬃菌科（Methanosaetaceae）和甲烷絲菌屬（Methanothrix）為它的優勢古菌菌群。

關鍵詞：TS濃度;豬糞;厭氧消化;甲烷;菌群結構

中圖分類號： S216.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0244-05

收稿日期：2018-01-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：51306155）;重慶市社會民生科技創新專項（編號：cstc2016shmszx80114）;中央高校基本科研業務費重點項目（編號：XDJK2017B059）。

作者簡介：王樂樂（1993—），男，甘肅平涼人，碩士研究生，主要從事可再生能源的開發和利用研究。E-mail：1628481822@qq.com。

通信作者：潘云霞，博士，副教授，主要從事有機廢棄物資源化和能源化利用、水污染控制等領域的研究。Email：panyunxia1@163.com。

生豬養殖在畜牧產業中占有重要地位。在生豬養殖過程中會產生大量豬糞，如果不及時有效地處理，會造成嚴重的環境污染[1]。利用豬糞中豐富的有機物進行厭氧消化，可在實現豬糞減量化的同時生產沼氣，是一種生態環保的糞污處理與再利用技術。豬糞中的高濃度氨氮對厭氧微生物有抑制作用，易導致厭氧消化啟動困難[2]，消除氨抑制是實現豬糞厭氧消化順利進行的關鍵。為此，本研究利用氨氮多溶于豬糞糞尿的特點，采用固液分離的豬糞固體進行厭氧消化，液體單獨處理，以期減小豬糞初始高濃度氨氮對厭氧消化的抑制作用。

厭氧消化中物料的流變特性對微生物的傳質以及沼氣的生產起到重要作用，流變特性和總固體（total solid，簡稱TS）濃度相關[3]，研究人員根據TS濃度不同，將厭氧消化分為3種類型，即濕發酵（TS濃度≤10%）、半干發酵（10%

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗裝置由筆者所在實驗室自行設計（圖1）。發酵罐容積為 2 500 mL，裝液量為1 200 mL，頂部設有出氣口及取樣口，發酵罐溫度通過外部水箱水加熱后泵送到發酵罐夾層保持，保持恒溫（35±1） ℃，集氣袋收集氣體，排水法測定產氣量。

1.2 試驗材料

試驗用豬糞取自重慶市某生豬養殖場糞污，總固體濃度為25.79%，揮發性固體（volatile solid，簡稱VS）濃度為2344%，總有機碳（total organic carbon，簡稱TOC）含量為184.87 g/kg，總氮（total nitrogen，簡稱TN）含量為31.18 g/kg。接種沼液取自實驗室發酵液，總固體濃度為9.85%，揮發性固體濃度為6.99%。

1.3 試驗方法

試驗于2017年3—6月在西南大學廢棄物資源化利用實驗室中進行。試驗采用批次發酵，將豬糞TS濃度調節到7%、10%、13%和16%，加入200 g接種沼液，調節各組pH值為7.0。反應初始時，通入2 min氮氣以保證厭氧環境。每日定時檢測pH值、NH4+-N含量、VFAs含量及產氣量，直至產氣結束。

1.4 項目測定及方法

TS濃度用烘干法測定，VS濃度用馬弗爐灼燒法測定;TOC含量的測定采用重鉻酸鉀-外加熱法;TN含量采用凱氏定氮法測定[7];pH值用pH計（Sartorius-10型）測定;NH4+-N含量用納式試劑光度法測定[8];甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量采用LC2010型高效液相色譜儀測定;總產氣量采用排水法測定;甲烷含量采用GC9720型氣相色譜儀進行分析測定;微生物優勢細菌及古菌類群分析通過IIIumina MiSeq高通量測序，菌群16S rDNA的雙V區（V3V4）PCR擴增引物信息為338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

2 結果與分析

2.1 TS濃度對豬糞厭氧消化過程的pH值和VFAs含量的影響

pH值是反映厭氧消化順利進行的重要指標。本研究中濕發酵、半干發酵和干發酵3種類型的pH值均整體呈現先下降后升高的趨勢（圖2）。厭氧消化初期，各組pH值迅速下降，在15 d時降至最低值，為5.2左右;而揮發性脂肪酸含量在該時期整體增加，15 d左右達到峰值，隨后VFAs含量逐漸降低，40 d后各組VFAs含量均降到7.0 mL/L及以下。推測這一時期豬糞中的有機物水解酸化產生大量VFAs且不能立即被產甲烷菌充分利用，進而造成VFAs積累。為避免酸化，在發酵后15 d，用NaOH對系統pH值進行調節（pH值為7）。發酵30 d后各發酵系統的pH值均穩定在6.5～8.1范圍內，且與VFAs總量的變化趨于一致。對于不同發酵類型，TS濃度對VAFs積累量的影響為TS16%>TS13%>TS10%>TS7%。

在3種類型發酵中，豬糞固體的厭氧消化整體以產乙酸和丙酸為主（圖3），這同Fang等的研究結果[9]一致。當豬糞TS濃度由7%增加到13%時，乙酸平均含量在VFAs平均含量中的占比由19.58%增加到35.14%，但當TS濃度增加到16%時，乙酸平均含量在VFAs平均含量中的占比稍有降低（33.09%）。TS濃度為7%、10%、13%、16%條件下，丙酸平均含量在VFAs平均含量中的占比分別為59.47%、60.07%、47.67%、50.16%。在3種類型的豬糞厭氧消化中，丁酸含量較低，甲酸的含量極低，丙酸、丁酸含量均呈現先升高后降低

的變化趨勢，而乙酸含量在5 d和80 d左右出現了2個高峰期。這是由于在厭氧消化初始階段，豬糞中易降解有機物水解產生乙酸，所以出現第1個產乙酸的高峰;產甲烷微生物利用丙酸的速率低于利用乙酸和丁酸的速率[10]，在發酵20～60 d 丙酸含量一直保持較高的水平，丙酸向乙酸的轉化可通過產氫產乙酸途徑和產甲酸產乙酸途徑[11]，圖3中甲酸含量一直保持在極低水平，由此推測產乙酸過程可能是沿著產氫產乙酸途徑進行的。由于丙酸的產氫產乙酸速率緩慢，所以60 d后，丙酸沿產氫產乙酸途徑轉化為乙酸后，丙酸含量降低，乙酸含量增加，出現第2個產乙酸高峰。TS濃度為13%和16%的豬糞，乙酸平均含量較7%和10%的發酵組分別提高了287.69%、449.94%和10838%、195.59%。厭氧消化中，大約有72%的甲烷來自于乙酸的轉化[12]，因此TS濃度為13%和16%的豬糞更有利于甲烷產量的提高。

2.2 不同TS濃度下豬糞厭氧消化的NH4+-N含量變化

NH4+-N既是微生物重要的氮源，也是影響厭氧消化過程穩定性的重要因素，過高的NH4+-N含量會對厭氧消化過程產生抑制作用[13]。由圖4可知，NH4+-N含量隨豬糞TS濃度的增加而增加，TS濃度為13%、16%的豬糞，

NH4+-N 含量最高可達2 319.2、3 012.1 mg/L，明顯高于其他組，由于NH4+-N是微生物可利用的氮源，2種TS濃度的豬糞，NH4+-N含量達到最大值后均開始波動下降，75 d后，NH4+-N含量分別穩定在1 500、2 000 mg/L左右。有研究表明，NH4+-N含量超過1 500 mg/L時，對厭氧消化產生抑制作用[14]，但4種TS濃度的豬糞在厭氧消化中均沒有產生氨抑制現象。

2.3 不同TS濃度下豬糞厭氧消化的產氣特性

由圖5可知，不同TS濃度的豬糞在厭氧消化20～35 d和60～80 d出現2次產氣高峰，TS濃度為7%和16%的豬糞，在第1次產氣高峰時，日產氣量維持較高的水平，而TS濃度為13%的豬糞，在第2次產氣高峰，日產氣量明顯高于其他各組。對整個發酵周期內各組的日產氣量計算平均值得到，TS濃度為7%、10%、13%、16%的發酵組日平均產氣量分別為2.43、2.41、3.02、2.78 mL/g。TS濃度為13%的發酵組日平均產氣量最高，并且其日平均產氣量較7%、10%、16%的發酵組提高了24.19%、26.23%、9.22%，累積TS產氣量達到 370.90 mL/g，也遠高于其他組（圖6）。不同TS濃度的豬糞日甲烷產量均整體呈現先增加后降低的變化趨勢。TS濃度為7%的豬糞日甲烷產量整體最低，TS濃度為13%的豬糞，厭氧消化80 d時甲烷產量達到峰值（395.85 mL/d），高于其他各組產甲烷峰值的含量;另外，通過圖6發現，TS濃度為16%的豬糞在發酵后期依然保持較高的甲烷產量，這主要是因為干發酵中發酵液的黏度高，氣-固-液傳質過程受阻礙[15]，雖然TS濃度為16%的豬糞在發酵后期依然保持較高的甲烷產量，但其厭氧消化遲滯期也較長。因此，從甲烷產量和經濟性方面綜合考慮，TS濃度為13%的半干發酵更有利于豬糞的發酵產氣。為此，對發酵末期TS濃度為13%的豬糞發酵液進行菌群結構分析。

2.4 發酵液優勢微生物類群分析

利用高通量測序技術對TS濃度為13%的豬糞發酵后期的細菌和古菌菌群進行分析，結果如圖7所示。厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）類細菌為優勢菌群，相對豐度分別達到29.5%、28.9%、25.5%和5.2%。其中厚壁菌門下的梭菌綱（Clostridia）及梭菌目（Clostridiales）類細菌在各分類單元中所占豐度分別達到27.7%和24.4%（圖7-a）。厚壁菌門（Firmicutes）類細菌是降解纖維素、長鏈脂肪酸及其他有機物生成小分子物質的主要菌類[16-17]，也是厭氧消化污泥、糞便、廢水和餐廚垃圾等厭氧反應器中常見優勢菌群，其門下的梭菌綱類細菌是具有較強纖維素降解能力的厭氧或兼性厭氧菌群，發酵系統中含有較多的梭菌能夠促進和提升微生物對纖維素的降解速率[18]。擬桿菌門類細菌則是利用大分子碳水化合物進行降解產酸的主要菌群。本研究高通量測序結果表明，系統中的優勢菌群（厚壁菌門和擬桿菌門細菌）在豬糞厭氧發酵水解、產酸過程中發揮著了重要的作用。這與Antwi等對廢水厭氧發酵中的微生物群落結構分析結果[19]相一致。廢水處理系統中參與丙酸型發酵的主要細菌是丙酸桿菌屬（Propionibacterium）類[20]。本研究中，系統發酵產生較高含量的丙酸，但高通量測序結果中的丙酸桿菌目（Propionibacteriaceae）和丙酸桿菌屬類細菌的相對豐度僅為0.2%和0.1%。這可能是菌群分析的樣品來自發酵末期，參與丙酸型發酵的細菌已退為次要地位所致。

古菌是厭氧發酵產甲烷的重要類群。本研究對高通量測序結果中的古菌類群進行了分析，結果如圖7-b所示。產甲烷相關的古菌類，如廣古菌門（Euryarchaeota）中的甲烷微菌綱（Methanomicrobia）、熱原體綱（Thermoplasmata）及甲烷桿菌

綱（Methanobacteria）所占豐度分別為29.6%、0.6%和0.5%。在目、科和屬的分類水平上，甲烷球菌目（Methanosarcinales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）和甲烷鬃菌科（Methanosaetaceae）及甲烷絲菌屬（Methanothrix）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）所占豐度分別達到20.8%、8.8%、17.2%及17.2%、3.6%。甲烷球菌可以H2、CO2和甲酸鹽為底物產生CH4，甲烷鬃菌和甲烷微菌可利用H2或甲酸鹽還原CO2生成CH4[21]，甲烷絲菌利用乙酸為底物產生CH4和CO2，甲烷八疊球菌屬可利用底物廣泛，能以乙酸、甲醇、三甲胺和CO2等為底物形成CH4[22]。發酵系統中的甲烷球菌目（Methanosarcinales）、甲烷鬃菌科（Methanosaetaceae）和甲烷絲菌屬（Methanothrix）為優勢古菌菌群，它們能充分利用豬糞酸化水解產物產生CH4，這也是TS濃度為13%的豬糞厭氧發酵產生較高含量甲烷重要原因之一。

3 討論

VFAs為產甲烷菌可利用的碳源，各有機酸的分布對厭氧發酵的順利進行和產甲烷性能影響很大。本試驗中，以豬糞固體進行厭氧消化，VFAs以乙酸和丙酸為主，并有少量丁酸和微量甲酸，這不同于趙杰紅等對廚余垃圾的研究，趙杰紅等在研究廚余垃圾厭氧消化水解酸化時發現，VFAs中以甲酸和乙酸為主，并有少量丙酸和丁酸產生，同時乳酸濃度一直較高[23];張波等對廚余廢物進行厭氧消化發現，pH值為7時，VFAs以丁酸和乙酸為主，丙酸很少[24]。雖然本試驗中丙酸濃度高，但系統并沒有出現酸化現象，而且發酵后期，大量的丙酸向乙酸轉化，這在TS濃度為16%的豬糞發酵中尤為明顯。丙酸向乙酸的轉化可通過產氫產乙酸途徑和產甲酸產乙酸途徑，試驗中檢測到極低的甲酸含量，推測丙酸向乙酸的轉化可能是通過產氫產乙酸途徑。pH值在5～7范圍內時為丙酸型發酵，丙酸型發酵的主要細菌是丙酸桿菌屬（Propionibacterium），但試驗中丙酸桿菌屬的相對豐度僅為 0.1%，這可能是發酵樣品取自發酵末期，丙酸桿菌屬菌群進入衰退期造成的。

4 結論

豬糞固體厭氧消化的濕發酵、半干發酵和干發酵都以產乙酸和丙酸為主，并有少量丁酸和微量的甲酸。TS濃度為13%的豬糞，乙酸平均含量占VFAs平均含量的比例最高，達35.14%，累積TS產氣量和日均產氣量分別為370.90 mL/g和 3.02 mL/g，高于其他各組。

TS濃度為13%的豬糞厭氧發酵液，優勢細菌菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria），相對豐度分別為29.5%、28.9%和25.5%，甲烷球菌目（Methanosarcinales）、甲烷鬃菌科（Methanosaetaceae）和甲烷絲菌屬（Methanothrix）為優勢微生物古菌菌群。

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