過(guò)表達(dá)中期因子增強(qiáng)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu耐藥及可能機(jī)制研究

慎華平 徐杰偉 朱霄峰 邱建 魏云海 張國(guó)雷 黃惠蓮 嚴(yán)強(qiáng)

[摘要] 目的 探討過(guò)表達(dá)中期因子（MK）增強(qiáng)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶（5-Fu）耐藥及其可能的機(jī)制。 方法 將SMMC 7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測(cè)MK mRNA和蛋白的表達(dá)。5-Fu處理后，采用MTT法檢測(cè)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥。采用WB法檢測(cè)磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和NF-κB及Bcl-2、survivin、caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果 將SMMC 7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)后，MK mRNA和蛋白的表達(dá)增加，Con-C組細(xì)胞對(duì)5-Fu的IC50顯著高于Con-A組、Con-B組[（27.36±4.31）mg/L vs （4.57±0.34）mg/L，（4.96±0.46）mg/L]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，與Con-A組、Con-B組比較，Con-C組細(xì)胞p-PI3K（0.66±0.04 vs 0.35±0.03，0.57±0.03）、p-Akt（0.31±0.02 vs 0.17±0.02、0.25±0.02）、NF-κB（0.63±0.05 vs 0.27±0.02，0.53±0.04）、Bcl-2（0.42±0.04 vs 0.13±0.01， 0.38±0.04）、survivin（0.58±0.04 vs 0.18±0.02，0.51±0.04）呈現(xiàn)高表達(dá)，caspase-3（0.41±0.04 vs 0.88±0.06，0.43±0.03）呈現(xiàn)低表達(dá)（P<0.05）。 結(jié)論 過(guò)表達(dá)MK可增強(qiáng)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu耐藥，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 肝癌;SMMC 7721細(xì)胞;中期因子;5-氟尿嘧啶;磷脂酰肌醇3-激酶;蛋白激酶B

[中圖分類號(hào)] R735.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）18-0041-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of overexpression of midkine（MK） on the resistance of SMMC 7721 cells to 5-fluorouracil（5-Fu） and its possible mechanism. Methods SMMC 7721 cells were transfected into pIRES2-EGFP-MK recombinant plasmid for overexpression. Real-time quantitative PCR（qPCR） and Western blot（WB） were used to detect the expression of MK mRNA and protein. After 5-Fu treatment， the resistance of SMMC 7721 cells to 5-Fu was detected by MTT assay. The expression of phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase（p-PI3K）， phosphorylated protein kinase B（p-Akt） and NF-κB， and Bcl-2， survivin and caspase-3 were detected by WB assay. Results After overexpression of SMMC 7721 cells transfected with pIRES2-EGFP-MK recombinant plasmid， the expression of MK mRNA and protein increased， and the IC50 of 5-Fu in Con-C group increased significantly than that in the Con-A group and Con-B group[（27.36±4.31） mg/L vs 4.57±0.34] mg/L，（4.96±0.46） mg/L]， and the difference was statistically significant（P<0.05）. In addition， compared with the Con-A group and Con-B group， p-PI3K（0.66±0.04 vs 0.35±0.03， 0.57±0.03）， p-Akt（0.31±0.02 vs 0.17±0.02， 0.25±0.02）， NF-κB（0.63±0.05 vs 0.27±0.02， 0.53±0.04）， Bcl-2（0.42±0.04 vs 0.13±0.01， 0.38±0.04）， survivin（0.58±0.04 vs 0.18±0.02， 0.51±0.04） showed high expression， caspase-3（0.41±0.04 vs 0.88±0.06， 0.43±0.03） showed low expression in the Con-C group（P<0.05）. Conclusion Overexpression of MK can enhance the resistance of SMMC 7721 cells to 5-Fu， and its mechanism may be related to the activation of PI3K/AKT signaling pathway.

[Key words] Liver cancer; SMMC 7721 cells; Midkine; 5-fluorouracil; Phosphatidylinositol 3-kinase; Protein kinase B

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)目前臨床上最常見的消化系惡性腫瘤，盡管手術(shù)切除腫瘤具有顯著的治療效果，但對(duì)于難以手術(shù)切除的中、晚期HCC，化療是其治療首選[1-3]。然而，HCC是一種對(duì)于化療不甚敏感的惡性腫瘤，其對(duì)化療藥物耐藥是影響化療治療效果的關(guān)鍵[4]。探討HCC化療耐藥機(jī)制，有針對(duì)性地對(duì)相關(guān)關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控，是有效改善HCC患者化療效果的重要手段。最新研究結(jié)果證實(shí)，中期因子（midkine，MK）在腫瘤的惡性生物學(xué)特性中發(fā)揮著重要的作用[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)肝癌細(xì)胞MK表達(dá)水平可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。前期研究結(jié)果也證實(shí)，沉默MK基因可增強(qiáng)肝癌Bel/Fu細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性[7]。但MK基因是否與耐藥有關(guān)及其可能機(jī)制報(bào)道尚少。眾多研究證實(shí)，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinaseB，Akt）信號(hào)通路及其相關(guān)因子NF-κB、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、凋亡抑制基因survivin、細(xì)胞凋亡終末剪切酶caspase-3在HCC發(fā)生發(fā)展中具有極其重要的作用[8-10]。但其與MK關(guān)系卻鮮見報(bào)道。本研究采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)MK肝癌SMMC 7721細(xì)胞系，觀察其對(duì)5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）耐藥情況，同時(shí)檢測(cè)上述蛋白的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

SMMC 7721細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與儀器

pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒（南京鐘鼎生物科技有限公司）;5-Fu（武漢易泰科技有限公司上海分公司）;RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Sigma公司）;胎牛血清（美國(guó)Sigma公司）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TIANGEN Biotech CO，LTD.）;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)試劑（美國(guó)Thermo公司）;兔抗人p-PI3K、p-Akt、Bcl-2多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）;兔抗人survivin、caspase 3、NF-κB、MK多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）;鼠抗人β-actin單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG（英國(guó)Abcam公司）;PCR引物由Sangon Biotech CO，LTD.合成。

1.3 觀察指標(biāo)

包括MK mRNA表達(dá)、SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu的IC50、p-PI3K、p-Akt、NF-κB、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白表達(dá)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)? SMMC 7721細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2下培養(yǎng)至細(xì)胞融合度>80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4.2 分組與轉(zhuǎn)染? 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將SMMC 7721細(xì)胞分為空白對(duì)照組（Con-A）;空載對(duì)照組（Con-B）：?jiǎn)斡胮IRES2-EGFP空載質(zhì)粒處理;轉(zhuǎn)染組（Con-C）：pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染：吸去SMMC 7721細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基700 μL;向已加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基300 μL的1.5 mL EP管中加入2.5 μg質(zhì)粒，輕輕混勻;向另一EP管中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基和5 μL脂質(zhì)體，使總體積同前一EP管，輕輕混勻;靜置5 min后，將兩管液體混合，靜置20 min，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)360 min后，更換含有血清、抗生素的培養(yǎng)基，繼續(xù)放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 qPCR檢測(cè)MK mRNA表達(dá)? 將各組處理后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行收集。按照試劑盒說(shuō)明，抽提細(xì)胞總RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，然后按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃下反應(yīng)3 min進(jìn)行預(yù)變性，隨后按94℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

引物設(shè)計(jì)如下：MK：5-CCCCAGCAGCCAGCAG-3，5-CGAGGAGGGTGAGGAGGAG-3，127 bp;β-actin：5-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3，5-GTCACCTTC-ACCGTTCCAGT-3，123 bp。

利用相對(duì)定量法和微軟EXCLE軟件進(jìn)行分析，計(jì)算公式為RQ=2-△CT，利用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行作圖。

1.4.4 WB檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)? 向提取好的細(xì)胞總蛋白中加入緩沖液進(jìn)行變性，時(shí)間為10 min，隨后取5 μL產(chǎn)物上樣在100 V恒壓條件下進(jìn)行SDS-Page電泳，冰浴120 min電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入50 g/L濃度脫脂牛奶常溫下封閉60 min，隨后加入適當(dāng)濃度一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜，次日用TBST漂洗5 min×5次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗5 min×5次，ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min后，吸去多余發(fā)光液，壓片5 min，顯影15 s，水洗凈進(jìn)行定影、顯影及曝光。以β-actin作為內(nèi)參照。白灰度分析使用的軟件是Image J，表達(dá)公式：目的蛋白/內(nèi)參。

1.4.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性? 按5000個(gè)/100 μL濃度，將細(xì)胞種植在96孔板上，加入0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 μg/mL的5-Fu，并設(shè)置空白對(duì)照和未加藥對(duì)照。所有細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后，將濃度為5 μg/L的MTT加入孔中，使每孔最終體積為20 μL。將96孔板放置于37℃溫箱中進(jìn)行孵育，時(shí)間為4 h。孵育結(jié)束后，向孔中加入DMSO，體積為150 μL。震蕩后，利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)每孔在490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（D）值。以公式細(xì)胞抑制率（%）=（未加藥物孔D 值-加藥物孔D 值）/（未加藥物孔D 值-空白孔D值）×100%。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。利用Biss 法計(jì)算IC50值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，mRNA相對(duì)表達(dá)量、IC50、相關(guān)蛋白表達(dá)量以（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMMC 7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒效果

qPCR檢測(cè)MK mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，Con-C組（0.0071±0.0023）細(xì)胞MK mRNA表達(dá)水平高于Con-A組（0.0026±0.0004）和Con-B組（0.0019±0.0003）（圖1），提示SMMC 7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒效果顯著，MK mRNA表達(dá)增高，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MK過(guò)表達(dá)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu的IC50

三組細(xì)胞分別處理后，Con-C組細(xì)胞對(duì)5-Fu的IC50[（27.36±4.31）mg/L]顯著高于Con-A組[（4.57±0.34）mg/L]（t=11.787，P=0.000）和Con-B組[（4.96±0.46）mg/L]（t=11.556，P=0.000），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示過(guò)表達(dá)MK基因可顯著增強(qiáng)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥。

2.3 MK過(guò)表達(dá)對(duì)SMMC 7721細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響

向三組細(xì)胞中加入20 μg/mL 5-Fu培養(yǎng)24 h，利用WB檢測(cè)SMMC 7721細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與Con-A組和Con-B組比較，Con-C組細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、NF-κB、Bcl-2、survivin呈現(xiàn)高表達(dá)，caspase-3呈現(xiàn)低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖2A、圖2B。

3 討論

HCC是我國(guó)常見危害嚴(yán)重的惡性腫瘤，其病理過(guò)程及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。由于HCC早期癥狀不明顯，確診時(shí)往往已發(fā)展為中晚期，化療成了HCC治療不可或缺的重要手段。然而HCC化療藥物耐藥是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。

MK是一種具有多種功能的分泌型生長(zhǎng)因子，隨著胚胎發(fā)育，從廣泛而高表達(dá)狀態(tài)，逐漸降低表達(dá)并局限在腎臟[11]。既往研究證實(shí)，MK在神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及其受損修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用[12]。近年來(lái)，隨著對(duì)MK基因研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)MK基因在腫瘤惡性生物學(xué)特征中也具有重要的作用。在乳腺癌[13]、肺癌[14]、胃癌[15]、結(jié)直腸癌[16]等眾多惡性腫瘤中，表現(xiàn)為促癌基因的特性。此外，在腫瘤化療藥物耐藥方面，MK基因表現(xiàn)出耐藥基因的特性，其可能是一種新的腫瘤化療藥物耐藥相關(guān)蛋白[15-16]。前期研究結(jié)果顯示，沉默MK基因可增強(qiáng)肝癌Bel/Fu細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[7];而過(guò)表達(dá)MK可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的耐藥性[17]。而關(guān)于MK基因耐藥機(jī)制的研究尚處在起步階段。PI3K/Akt信號(hào)通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路。目前，已有研究顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路參與了肝癌細(xì)胞耐藥[18-20]。為進(jìn)一步探索MK基因、肝癌細(xì)胞耐藥和PI3K/Akt信號(hào)通路及相關(guān)蛋白之間的關(guān)系，本研究通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)MK肝癌細(xì)胞系，觀察對(duì)5-Fu耐藥及相關(guān)蛋白的影響。

本研究結(jié)果顯示，SMMC 7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒后，其MK mRNA表達(dá)水平高于其他兩組。提示SMMC 7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒效果顯著，MK mRNA表達(dá)增高，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后，本研究利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性，結(jié)果顯示，三組細(xì)胞分別處理后，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒組細(xì)胞對(duì)5-Fu的IC50顯著高于其他兩組。提示過(guò)表達(dá)MK基因可顯著增強(qiáng)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥。為了進(jìn)一步探討其耐藥機(jī)制，本研究觀察了MK過(guò)表達(dá)對(duì)SMMC 7721細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響，結(jié)果顯示，與其他兩組比較，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-MK重組質(zhì)粒組細(xì)胞的p-PI3K、p-Akt、NF-κB、Bcl-2、survivin表達(dá)水平呈現(xiàn)高表達(dá)，caspase-3表達(dá)水平呈現(xiàn)低表達(dá)。PI3K/Akt信號(hào)通路是一條經(jīng)典的促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。該信號(hào)通路過(guò)度活化后，可引起多種惡性腫瘤的化療藥物耐藥。NF-κB、Bcl-2、survivin及caspase-3是PI3K/Akt信號(hào)通路中相關(guān)的重要蛋白，受PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控，其改變可能與MK過(guò)表達(dá)引起PI3K/Akt信號(hào)通路活化有關(guān)。

綜上所述，初步推測(cè)過(guò)表達(dá)MK可增強(qiáng)SMMC 7721細(xì)胞對(duì)5-Fu耐藥，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。但由于上述基因之間存在復(fù)雜的Crosstalk，對(duì)于MK在肝癌化療藥物耐藥中的機(jī)制研究仍任重道遠(yuǎn)。

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（收稿日期：2019-03-12）