樹鼩BACE1全長編碼序列的克隆及分子特征分析

苗雨潤，李明學，李 娜，王文廣，匡德宣，仝品芬，孫曉梅，罕園園，陸彩霞，代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心，昆明 650118)

β-淀粉樣前體蛋白切割酶(beta-site APP cleaving enzyme-1，BACE1)是一種β-分泌酶，屬于天冬氨酸蛋白酶，也稱之為asp2或memapsin-2[1]，目前認為β-分泌酶能夠特異靶向膜結合底物，且對底物的切割具有序列特異性，切割APP形成β-淀粉樣多肽 (β-amyloid peptide, Aβ) 的N端以啟動Aβ生成，可能是導致阿茲海默病發病的直接原因。

阿茲海默病 (Alzheimer’s disease，AD)，是發生在老年期及老年前期的一種原發性神經退行性疾病，表現為持續性的高級神經功能活動障礙。據報道，該病特征性病理變化表現為大腦皮層萎縮，并伴有β-淀粉樣蛋白沉積，記憶性神經元數目大量減少，神經細胞內出現神經纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)以及出現老年斑(senile plaque)[2-4]。迄今為止，關于AD的發病機制尚不明朗。但Hardy等[5]提出了以β-淀粉樣多肽為核心的Aβ學說，近年來，針對AD遺傳學及分子生物學的相關研究也更加有力地支持了Aβ學說：Aβ的產生與代謝、解離與凝聚的不均衡導致異常多的Aβ不斷聚積形成老年斑，由此導致了其他如軸突和神經細胞缺失，神經纖維纏結等一系列的病理改變[6]。因此，Aβ的聚積被認為是AD病理改變發生的起始環節。Aβ來源于β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein, β-APP)，其在體內有兩種裂解途徑：非淀粉樣途徑和淀粉樣途徑。前者是指α-分泌酶在β-APP的第16位氨基酸殘基處裂解，其不產生完整的Aβ，該途徑不引起淀粉樣蛋白沉積；后者是指β-分泌酶在β-APP的N端進行裂解，產生了包含完整Aβ序列的β-CTF (C-terminal fragments)，之后γ-分泌酶裂解β-CTF產生了一系列長短不等的Aβ，其中Aβ42是組成老年斑的主要成分[7]。BACE1作為一種β-分泌酶，有研究報道，BACE1基因敲除的小鼠腦內沒有Aβ的產生，日常活動沒有異常[8]，這提示可以通過阻斷Aβ的產生來改善甚至治療AD，此法的優勢還在于這樣做可能不存在不良反應。近年來BACE1抑制劑已成為藥物開發的熱點，在治療AD方面具有很強的應用前景。

樹鼩(Tree shrew,Tupaiabelangerichinesis)作為一種新型實驗動物，近年來受到廣泛關注，其基因組序列的測定和分析表明其比小鼠和大鼠更接近于非人靈長類，加之體型小、飼養成本低等特性，目前已被廣泛應用于人類疾病模型的構建及相關領域的研究，具有很強的應用潛力[9]。近年來有關于樹鼩抑郁癥模型的建立揭示了樹鼩不同于嚙齒類動物的神經系統可能更適合作為人類神經系統疾病研究的實驗動物[10-11]。Fan等[12]將樹鼩與人、獼猴和小鼠的腦組織中與AD相關131個基因進行了同源性比對，結果顯示樹鼩腦組織中Aβ累積與NFTs的表達模式與人類腦組織相似，而且具有類似的年齡依賴效應，此外，相較于小鼠，樹鼩與人類AD相關基因的序列具有更高的同源性。這些研究為樹鼩可能更適合建立AD動物模型提供了有力的證據。但迄今為止，尚未有關于樹鼩BACE1分子克隆的研究報道。因此，本研究采用RACE技術獲得樹鼩BACE1全長編碼序列為目的，并對其序列和分子特征進行分析，為今后建立樹鼩AD模型或將樹鼩應用于AD藥物的研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級滇緬樹鼩，成年樹鼩體重約130 g，幼年樹鼩體重不作要求，雌雄不限，幼年組實驗樹鼩(42～52日齡)3只；青年組(15～18月齡)3只；老年組(78～86月齡)3只。由中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心提供[SCXK(滇) K2018-0002]；實驗操作均在中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心內進行[SYXK(滇) K2018-0002]，實驗過程嚴格遵循實驗動物使用的3R和福利倫理原則。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹鼩BACE1的分子克隆

(一)BACE1引物設計

根據Genbank已經注冊登記的人BACE1(NM_000011.10)、小鼠BACE1(NM_001145947.2)和獼猴BACE1(NM_001260928.1)的保守序列，設計表一中的4組引物，該4組引物分別覆蓋了樹鼩BACE1 mRNA的整個編碼區(表1)。

表1 樹鼩BACE1 PCR RACE引物設計

(二)RNA與cDNA制備

取腦組織放入1.5 mL離心管，采用柱式TRIzol總RNA提取試劑盒(生工B511321)提取組織總RNA，并采用3’adaptor 引物和M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit M-MuLV試劑盒(生工B532435)一步法逆轉錄成cDNA，并去除基因組DNA污染。

(三)普通PCR

以3’adaptor為反轉錄引物的cDNA為模版，采用表一中BACE1-F和BACE1-R中間序列擴增引物和TaKaRa Ex Taq? Hot Start Version試劑盒進行普通PCR，進行基因調取。循環參數：95℃ 3 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min、33個循環；72℃ 7 min。PCR產物電泳后回收測序。

(四)3’RACE巢式PCR

以3’adaptor為反轉錄引物的cDNA為模版，采用3’RACE 特異性引物和接頭引物進行巢氏PCR。

采用BACE1-F1和5.3’outer引物進行第一輪PCR，循環參數：95℃ 3 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min、33個循環；72℃ 7 min。以第一輪PCR產物為模版，采用BACE1-F2和5.3’ inner引物進行第二輪PCR，循環參數：95℃ 3 min；94℃ 30 s、58℃ 58 s、72℃ 1 min、33個循環；72℃ 7 min。PCR產物電泳后回收測序。

(五)5’RACE巢式PCR

以特異性引物BACE1-RT1、BACE1-RT2進行反轉錄，得到cDNA，經RNase H 和TdT處理后，采用5’RACE 特異性引物和接頭引物進行巢氏PCR。

以5’adaptor和BACE1-R1為引物進行第一輪PCR，循環參數：95℃ 3 min；94℃ 30 s、68℃ 30 s、72℃ 1 min、33個循環；72℃ 7 min。

以第一輪PCR產物為模版，采用5’outor和BACE1-R2引物進行第二輪PCR，循環參數： 95℃ 3 min；94℃ 30 s、68℃ 68 s、72℃ 1 min、33個循環；72℃ 7 min。

(六)測序

PCR產物交由公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)測序。將PCR純化產物插入pMD-18T載體后，轉化大腸桿菌感受態細胞，提取質粒進行雙酶切鑒定，最終進行雙向測序。進行序列拼接得到全長編碼序列，拼接時要求序列間堿基重合大于40 bp，一致性大于90%。

1.2.2 序列分析

文中所用的參考蛋白質及核酸序列均來源于GenBank，利用MEGA10.0.5推導其蛋白質編碼區(CDS)開放閱讀框(ORF)及氨基酸序列，使用PyMOL分別進行蛋白質三維模型的構建，利用在線軟件SWISS-MODEL(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html) 及SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 對BACE1蛋白氨基酸序列及蛋白質模型結構進行分析。將其核酸序列與NCBI 數據庫進行比對，下載 NCBI 數據庫中其他物種的BACE1氨基酸序列，利用MEGA 10.0.5中Neighbour-Joining、bootstrap 置信度1000次自導復制構建系統進化樹。

1.2.3BACE1的表達模式分析

(一)RNA相對表達定量

對幼年組、青年組和老年組樹鼩腦組織(頂葉、額葉、顳葉、枕葉、海馬體和小腦)中提取總RNA。在MyIQ2雙色實時PCR檢測系統上，使用One Step TB GreenTMPrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)和表2中的BACE1特異性引物(BACE1-F和BACE1-R)與內參GAPDH特異性引物(GAPDH-F和GAPDH-R)進行qRT-PCR。數據處理使用非參數秩和檢驗Kruskal-Wallis法,檢驗mRNA表達量與實驗動物年齡之間的等級關系，當P<0.05時，差異具有統計學意義。

表2 RT-PCR實驗所用引物序列

(二)Western blotting

對收集的組織提取蛋白。超聲波破碎儀破碎組織，并用含PMSF的裂解液裂解細胞。蛋白濃度測定按照碧云天(增強型)BCA試劑盒說明書操作進行。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western blotting標準方法，25 mg總蛋白的上樣量，分別用抗BACE1(2338e53，AffinitY)和β-actin(8H10D10，ABGENT)抗體4℃過夜孵育，TBST清洗3次，每次10 min。搖床常溫孵育二抗60 min，TBST清洗3次，每次10 min。最后采用ECL底物化學發光法進行顯色， Bio-Rad凝膠成像系統進行顯色。

2 結果

2.1 RACE 結果與序列分析

以樹鼩腦組織總RNA, 反轉錄后進行PCR擴增測序。將中間序列及5’和3’RACE實驗得到的序列進行拼接，得到樹鼩BACE1基因全長序列為1 406 bp，其中CDS區為804 bp，3’末端非編碼區200 bp，5’末端非編碼區 402 bp(圖1)，GenBank登錄號：MK766412。DNAMAN分析結果顯示樹鼩BACE1 CDS區編碼267個氨基酸，分子量約為224.74×103(圖2)。利用MEGA10.0.5構建進化樹進行系統發育分析，發現樹鼩與灰狼的BACE1基因的親緣關系較為接近，這與實驗預期估計有所差異(圖3)。

注：M為Marker，1為BACE1-3’RACE結果，2為BACE1-5’RACE結果，圖中未標注條帶不屬于本實驗涉及結果。圖1 樹鼩BACE1基因RACE擴增電泳圖Note. M is marker, 1 is the result of BACE1-3′RACE, 2 is the result of BACE1-5′RACE, and the unlabeled band in the figure is not the result of this experiment.Figure 1 Electrophoresis map of RACE amplification of tree shrew BACE1

圖3 樹鼩和其他物種BACE1之間的親緣關系Note. bootstrap:10 000 replicates; method: Neighbour-Joining.Figure 3 Relationship between tree shrews and other species BACE1

注：相同的氨基酸位點在陰影部分表示，其中共同基序用陰影畫出，潛在的N-糖基化位點用黃色圓形標出，潛在的磷酸化位點用橙色菱形標出，潛在的乙酰化位點用藍色三角形標出，跨膜結構域及膜內結構域上潛在的脂質結合位點用綠色同心圓標出。圖4 樹鼩BACE1 CDS區氨基酸序列與人，小鼠的比對分析Note. The same amino acid position is indicated in the shaded part, where the common motif is shaded, the potential N-glycosylation site is marked with a yellow circle, and the potential phosphorylation site is marked with an orange diamond. Potential acetylation sites are indicated by blue triangles, and potential lipid-binding sites on the transmembrane domain and the intramembrane domain are marked with green concentric circles.Figure 4 Analysis of amino acid sequence of BACE1 CDS region in tree shrews with human and mouse

2.2 樹鼩BACE1氨基酸序列的分析

通過比對，樹鼩BACE1蛋白CDS區的氨基酸殘基序列與人類序列比對重合度高達98.87%，其中有三個氨基酸殘基有差異，包括41位堿基差異(K41→N41)、204位堿基差異(L204→P204)及254位堿基差異(Q254→H254)。采用Clustal W推導出的樹鼩BACE1蛋白CDS區氨基酸殘基序列，并參照GenBank中人的BACE1的結構域注釋做出比對，發現兩者同屬跨膜蛋白并具有相同的跨膜結構域，總體結構包括胞外結構域(1-223)、跨膜結構域(224-244)及胞內結構域(245-267)，并擁有1個相同的糖基化位點(N125)、4個相同的乙?；稽c(K45、K51、K65、K66)及一個相同的磷酸化位點(S264)；但是人和小鼠還存在一個額外的乙酰基位點(K41)，這是樹鼩所沒有的，造成這種原因可能是由于樹鼩BACE1核苷酸序列與人類在第41位堿基的差異(K41→N41)所導致，這也可能是兩者表面絕對電荷分布產生差異的重要原因。其跨膜結構域和胞內結構域還存在4個位置相同的脂質結合位點及一個拓撲結構域(圖4)。

2.3 BACE1蛋白三維結構分析

使用ExPASy-ProtParam工具對樹鼩BACE1氨基酸序列進行分析，分析結果顯示，該蛋白分子量預測結果為30358.96，親水性平均值(GRAVY)為0.034，等電點為5.04，蛋白由20種不同的氨基酸殘基構成，其中纈氨酸(Val)含量最高(7.9%)，異亮氨酸(lle)(7.5%)、亮氨酸(Leu)(7.5%)、丙氨酸(Ala)(6.7%)及天冬氨酸(Asp)(6.7%)的含量都相對較高。利用SignaIP 3.0 Server在線預測軟件對樹鼩BACE1蛋白進行蛋白質N-末端信號肽預測，預測結果顯示該蛋白無信號肽(圖5)。使用ExPASy-ProtScale在線分析軟件，對樹鼩BACE1蛋白的親疏水性進行預測，結果如圖6所示，圖形的高峰值(正值)的區域表示疏水的區域，而負值的“低谷”區域是親水區域，樹鼩BACE1蛋白絕大部分區域屬于親水區域，一般認為蛋白的膜外的部分為親水區，而跨膜區域為疏水區，此結果與TMHMM蛋白的結構域位置預測結果非常一致。

通過SWISS在線預測軟件進行樹鼩BACE1蛋白的結構模型構建，之后通過APBS和Pymol在線軟件分別對樹鼩BACE1分子表面絕對電荷和蛋白三維空間結構進行分析。結果顯示，預測的樹鼩BACE1蛋白結構與人具有高度一致性，在空間結構和分子表面電荷分布基本一致，同時在膜內結構區存在一個高度保守的DXXLL的ACDL分選內吞基序。兩者胞外結構域均由間隔分布的兩部分折疊結構組成，包括一個包含3個α螺旋和4個β折疊片以α-β-β-α-β-β-α的排序構成的折疊結構，以及一個包含7個α螺旋及9個β折疊片以α-β-α-β-β-α-β-α-β-β-β-α-β-α-β-α的排序構成的折疊結構，但由于兩者在第一個折疊結構的氨基酸序列上存在差異，這導致了樹鼩在31位到48位殘基的空間構象上存在差異。此外，其胞內結構域由于堿基結構不同可能導致其拓撲結構域在空間構象上存在差異。此外，研究人員在樹鼩BACE1蛋白上同樣找到了四個氫鍵，以及兩對二硫鍵(C44-C209及C96-C146)，其分布位置均相同，認為這可能是兩者空間構象高度相似的重要原因(圖7)。

同時比較BACE1蛋白模型的分子表面絕對電荷分析，發現兩者的分子表面絕對電荷分布基本一致，表現為樹鼩BACE1蛋白的21位、22位及174位、176位及178位均為帶正電荷的精氨酸，這兩個殘基剛好暴露于分子表面，因而導致該區域帶上了較強的正電荷。這與人的BACE1蛋白的表面絕對電荷是高度一致的。雖然兩者分子表面絕對電荷分布基本一致，但在局部仍存在一定差異，具體表現為由于第41位的氨基酸殘基序列的差異，導致人的BACE1在該位置帶正電荷而樹鼩的BACE1在該位置為中性電荷(圖8)。

圖5 樹鼩BACE1蛋白的信號肽預測Figure 5 Signal peptide prediction of tree shrew BACE1 protein

圖6 樹鼩BACE1蛋白跨膜結構與親疏水性預測Figure 6 Analysis of transmembrane structure and hydrophobicity of tree shrew BACE1 protein

注：圓圈部分為結果討論中比較的差異區域。圖7 人和樹鼩BACE1蛋白三維結構構建與球棒模型比較Note. The circled part is the difference area compared in the result discussion.Figure 7 Comparison of the three-dimensional structure construction of human and tree shrew BACE1 proteins

注：與其他兩組相比，*P<0.05。圖9 不同年齡組樹鼩大腦不同組織中BACE1 cDNA的相對表達量Note.Compared with other two groups,*P<0.05.Figure 9 Relative expression of BACE1 cDNA in different tissues of tree shrews in different age groups

圖8 人和樹鼩BACE1蛋白表面絕對電荷差異性比較Figure 8 Comparison of absolute surface charge differences between BACE1 proteins of humans and tree shrews

2.4 樹鼩BACE1基因在不同年齡段腦組織的表達分析

用qPCR方法對樹鼩大腦中不同組織的BACE1相對表達量伴隨實驗動物年齡的變化情況也做了相關的研究分析。結果顯示，伴隨著樹鼩的年齡增長，BACE1表達量變化情況在大腦中枕葉與海馬體中表現顯著，差異有等級相關，呈非線性正相關；在顳葉部位的表達量有一定變化，差異具有等級相關，呈線性正相關；但在頂葉與小腦及額葉中表達量變化不明顯或差異不具有等級相關(圖9)。

2.5 樹鼩BACE1蛋白的表達模式分析

對樹鼩大腦及外周組織的BACE1蛋白表達做了Western blot驗證實驗，結果顯示，BACE1蛋白在除樹鼩的腦組織(頂葉、枕葉、顳葉、額葉、海馬和小腦)明顯表達外，在外周組織腎臟、胰臟及肝臟也有一定程度的表達(圖10)。

3 討論

圖10 樹鼩大腦各部位BACE1蛋白表達Western Blot實驗結果Figure 10 Western blot results of BACE1 protein expression in various parts of the brain

本研究通過RACE (rapid-amplification of cDNA ends)實驗得到樹鼩BACE1基因的全長序列，并利用樹鼩BACE1基因序列和其他11類物種的BACE1基因序列進行系統發育分析，在構建進化樹進行系統發育分析的過程中，發現樹鼩BACE1與灰狼屬的親緣關系較為接近，反而與人類、小鼠等物種的BACE1的親緣關系相對較遠，這與預期估計有所偏差，這是否揭示樹鼩的β-分泌酶在進化過程中是否由于環境因素或其他原因導致，使得β-分泌酶在進化策略上與靈長類的出現差異。

誠然，如果基于BACE1基因序列相似度分析的角度來講，較獼猴等靈長類動物和人類BACE1核酸序列相似度相比，樹鼩作為AD模式動物的研究中可能并不占優勢，但如果從氨基酸殘基序列的角度來分析，研究人員認為樹鼩仍然有作為AD動物模型研究的應用前景。根據已有的關于人類的BACE1蛋白結構的報道[13-14]及筆者用樹鼩與人類BACE1氨基酸殘基序列比對結果，發現兩者相似性非常高，他們擁有相同的胞外結構域、跨膜結構與及胞內結構域，并且擁有高度相似的配體結合位點，基于以上結果可以推斷，樹鼩BACE1蛋白的基本結構應與人BACE1蛋白結構基本相似。在對BACE1蛋白三維結構建模及空間構象建模的過程中發現，兩者的蛋白質三維空間結構與表面絕對電荷分布基本一致，這與兩者的氨基酸殘基序列高度一致性可能有直接關系，此外，與兩者的高度相似的二級結構及相同的氫鍵、二硫鍵位置也可能存在很大的關聯[15-16]。在表面絕對電荷分布分析的過程中，筆者認為兩者在電荷和空間構象上可能保有高度的一致性，但其中仍存在一定差異，至于這些差異是否會影響到樹鼩BACE1與其它分子的結合，還有待進一步的實驗驗證。除此之外還發現，樹鼩與人類的BACE1蛋白在膜內結構區均存在一個高度保守的DXXLL的ACDL分選內吞基序，有報道稱，該基序可能與BACE1的外功能區與β-APP的外功能區之間的相互作用有直接關系[15,17-18]，當然相關具體的分子機制仍有待進一步研究結果支持，但如果論點得到支持，研究人員有理由可以相信，樹鼩在由BACE1蛋白介導的β-APP的淀粉樣裂解途徑應該與人類是一致的，這無論對于樹鼩作為AD模型的構建還是作為BACE1抑制劑藥物研究的實驗動物都是具有一定的積極意義的。

此前有報道稱，發現了β-分泌酶的第二種亞型，并命名為BACE2，該蛋白主要在心臟、腎臟和胎盤組織表達，而在腦組織中表達量極少。因此，推斷BACE2可能在Aβ的產生中不占重要地位[19]。本研究的Western blot驗證實驗結果可以提示，筆者發現的樹鼩BACE1蛋白應不屬于這種亞型，而與影響AD形成的BACE1更加相似。除此之外，對樹鼩不同組織及大腦的不同部位的BACE1蛋白表達做了Western blot驗證實驗，結果表明，BACE1蛋白在樹鼩的腎臟和胰臟有表達，并在大腦的頂葉和枕葉中具有表達，這與預測的情況相吻合，也與人類BACE1蛋白表達情況保持高度一致[20-22]。除此之外，對不同年齡組別的樹鼩大腦中不同部位的BACE1的mRNA表達量做了相對定量分析，結果顯示，由于年齡增長的影響因素伴隨BACE1的表達量差異集中體現于樹鼩大腦中的枕葉、顳葉與海馬體；據報道，枕葉的功能作用體現于負責處理語言、動作感覺、抽象概念及視覺信息[23]；顳葉的功能作用表現在負責處理聽覺信息，也與記憶和情感有關[24]；而海馬體則主要負責長時記憶的存儲轉換和定向等功能[25]；據此分析，如果大腦中的這三個部位功能喪失確實可能引起個體產生符合AD的所有臨床表現，包括但不限于記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現[26]。這一發現說明樹鼩大腦中由β-分泌酶介導切割APP形成β-淀粉樣多肽以啟動Aβ生成發生的主要位置及發生功能破壞及損傷的部位是以上三個部位，而與大腦中其他組織部位關聯性不強，也證實了樹鼩與人類在β-分泌酶介導的β-APP淀粉樣途徑的發生部位可能是一致的，更有力的說明了樹鼩可以作為AD模型的應用研究的可行性；這一結果也提示，如果可以利用BACE1抑制劑藥物來達到治療或預防AD的目的，是否可以直接從這三個大腦分區入手以減輕藥物對大腦的負面作用，或者可以依此來提高藥物的有效性及準確性，基于此研究人員是否可以認為，樹鼩可能是作為研究AD病理改變或藥物研究潛在的理想模型。