淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ對氣管切開大鼠T細胞亞群及細胞因子的影響①

鞠 靜 譚人千 姚金茜 彭玲玲 黃宗軒 潘宇政 韋進新

(廣西醫科大學第一附屬醫院,南寧 530021)

氣管切開術是臨床搶救危急重癥患者采取的必要手段，但是氣管切開后易并發肺部疾病，結合中醫理論及現代醫學研究，應重視肺病從腎論治的研究[1,2]。補腎陽中藥淫羊藿(Herba epimedii)是小檗科多年生的草本植物,其有效化學成分主要有黃酮類和木脂素類化合物。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是淫羊藿中主要的活性成分,屬于黃酮類化合物。淫羊藿次苷Ⅱ(Icariside Ⅱ,ICS-Ⅱ)又名寶藿苷Ⅰ,是ICA的主要腸道代謝產物之一。我們前期實驗研究發現淫羊藿水提取物對氣管切開大鼠具有提高免疫的作用[3]。本實驗將從T細胞亞群、細胞因子IL-6及大鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)角度，繼續探討溫腎陽治肺病的分子機制，旨在找到淫羊藿發揮作用的有效單體成分，為臨床治療氣管切開后引起的肺部疾病提供有力的實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 ICA、ICS-Ⅱ(上海源葉生物科技有限公司，HPLC 98%),sIgA、大鼠IL-6酶聯免疫檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司),熒光標記單克隆抗體(美國BD公司)，流式細胞儀(美國BD公司FACSCalibur型)。

1.2方法

1.2.1實驗動物與分組 SD大鼠，體重(250±20)g，雄性，SPF級[廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(桂)2014-0002]。隨機分成正常對照組(A)、模型對照組(B)及模型治療組(C、D)，每組18只。飼養環境溫度為(20±2)℃，濕度60%，自由進水，普通飼料喂養。

1.2.2模型制備與給藥 參照文獻[4]制備B、C、D組大鼠氣管切開插管模型。動物模型制作成功后6 h進行給藥干預。C組給予ICS-Ⅱ4 mg/(kg·d)、D組給予ICA 30 mg/(kg·d)灌胃，A、B 組給予等量0.9%生理鹽水，每日1 次。

1.2.3取材 給藥后第24、72、168小時，各組分別取材6只大鼠。用10%(0.35 ml/100 g)水合氯醛腹腔麻醉后，剖開腹腔，經腹主動脈分別采血2 ml置于肝素抗凝管中(用于測定T細胞亞群)、3～4 ml置于普通非抗凝管中(用于測定血清IL-6含量)。 采集完外周血后立即剖開胸腔,用止血鉗夾閉右主支氣管，用4℃預冷滅菌0.9%生理鹽水3 ml反復灌洗肺部3次，共回收肺泡灌洗液約6 ml(用于測定sIgA、IL-6含量)。

1.2.4外周血T細胞亞群檢測 嚴格按照試劑說明書加樣后，上機檢測。用專業流式數據分析軟件 FlowJo 計算CD4+T、CD8+T細胞數量及CD4+/CD8+數值。

1.2.5肺泡灌洗液IL-6、sIgA及血清IL-6檢測 均嚴格按照試劑盒說明書操作。 用專業軟件CurveExpert 13.0計算每個樣本的濃度。

2 結果

2.1大鼠外周血CD4+T細胞亞群 結果見圖1、表1。 B組大鼠氣管切開插管后外周血CD4+T細胞亞群數量無明顯變化。C、D兩組與B組相比,C組在168 h明顯高于B組(P=0.043)，D組在72 h、168 h明顯高于B組(P=0.016、0.001)。D組在168 h明顯高于C組(P=0.006),C、D兩組組內各時段相比，C組無明顯變化，D隨著時間延長逐漸升高。這些結果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可提高外周血CD4+T細胞亞群數量，且ICA效果優于ICS-Ⅱ，以168 h最顯著。

2.2大鼠外周血CD8+T細胞亞群 結果見圖1、表2。 B組氣管切開插管大鼠CD8+T細胞亞群數量開始明顯降低，168 h與A組相比無明顯差異。C、D兩組與B組相比，C組在72 h、168 h明顯低于B組(P=0.034、0.006)；D組與B組無明顯變化。D組在72 h明顯高于C組(P=0.030)。C、D兩組組內各時段相比，C組以72 h降低最明顯(P=0.001)，D組各時段無明顯差異。這些結果提示，ICA和ICS-Ⅱ均可降低外周血T細胞亞群CD8+含量。

2.3大鼠外周血CD4+/CD8+T細胞亞群 結果見圖1、表3。B組氣管切開大鼠外周血T細胞亞群CD4+/CD8+在24 h、168 h與A組相比無明顯差異。C組在24 h明顯高于A組(P=0.018)，在168 h CD4+/CD8+值雖有降低，但差異無統計學意義；且與B組相比差異無明顯統計學意義。D組在168 h明顯高于A、B、C 3組(P=0.000、0.000、0.001)。C組組內各時段無明顯差異；D組168 h明顯高于24 h、72 h(P=0.001、0.005)。這些結果提示，ICA和ICS-Ⅱ均可提高氣管切開大鼠外周血CD4+/CD8+T細胞亞群的比值，且ICA效果優于ICS-Ⅱ。

2.4大鼠外周血IL-6含量 結果見表4。B組氣管切開插管后大鼠外周血IL-6含量在72 h明顯降低(P=0.003)。C、D兩組IL-6含量在3個時段均明顯低于A、B組(P<0.05)。D組在168 h明顯低于C組(P=0.031)。C、D兩組組內各時段IL-6含量無明顯變化。這些結果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可抑制氣管切開插管后大鼠外周血IL-6表達，且ICA效果優于ICS-Ⅱ,以168 h最顯著。

2.5大鼠肺泡灌洗液IL-6含量 結果見表5。 B組氣管切開插管后肺泡灌洗液IL-6含量在3個時段均明顯高于A組(P=0.003、0.000、0.003)。 C、D兩組與B組相比， 在72 h、 168 h時段明顯低于B組，且呈逐漸降低趨勢(P<0.05)，D組與C組相比無明顯差異。這些結果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可抑制氣管切開插管后大鼠肺泡灌洗液IL-6表達，且二者作用效果無明顯差異。

圖1 各組外周血CD4+、CD8+T細胞亞群Fig.1 Peripheral blood CD4+，CD8+T cells in each group

Groupsn24 h72 h168 hFPA624.547±4.11123.691±4.35624.282±4.3940.0350.966B623.396±3.91420.370±0.25022.388±2.2171.2740.321C621.021±4.57923.991±10.73228.930±3.2931.6000.249D618.076±0.311 26.320±2.64737.552±5.12034.1320.000F2.5230.65211.374P0.1000.5980.001

Groupsn24 h72 h168 hFPA613.511±2.03413.259±2.67313.786±1.9370.0350.966B69.501±2.2597.873±0.12414.700±2.9028.4280.011C68.283±1.5114.993±0.0969.095±0.53119.1830.000D69.280±1.2378.416±2.56211.559±1.0213.0340.105F8.15012.8897.230P0.0020.0010.009

2.6大鼠肺泡灌洗液sIgA含量 結果見表6。 B組氣管切開插管后大鼠肺泡灌洗液sIgA含量24 h即明顯升高(P=0.006)，但在72 h后又降至正常組水平；C、D兩組在72 h、168 h明顯高于B組(P<0.05)；D組在24 h、168 h兩個時段明顯高于C組(P<0.05)。這些結果提示，ICS-Ⅱ和ICA均可提高氣管切開插管后大鼠肺泡灌洗液sIgA含量，且ICA效果優于ICS-Ⅱ，以24 h、168 h最顯著。

Groupsn24 h72 h168 hFPA61.843±0.3671.825±0.2101.855±0.3860.0060.994B62.056±0.4722.512±0.1202.161±0.4201.2520.321C62.480±0.2032.652±0.5612.226±0.2831.5220.265D62.042±0.3122.330±0.4183.256±0.30713.2080.002F2.9802.77910.886P0.0630.1020.001

Groupsn24 h72 h168 hFPA639.299±3.26239.100±1.23939.409±2.3200.0110.989B639.876±2.25231.924±1.93935.682±1.62412.4180.007C626.477±2.30027.382±1.78129.714±2.8502.3330.143D629.293±5.76227.589±2.88925.462±2.1621.1950.336F14.29618.81724.331P0.0000.0000.000

Groupsn24 h72 h168 hFPA60.490±0.1240.478±0.1300.489±0.1010.0090.991B61.455±0.3231.159±0.2250.748±0.0779.1930.011C61.556±0.4170.859±0.0270.537±0.03413.8820.006D61.213±0.3110.930±0.1460.519±0.0099.2680.015F7.30124.4067.435P0.0090.0000.011

Groupsn24 h72 h168 hFPA63.886±1.6443.278±1.2383.641±1.0850.1540.861B68.328±2.2114.185±1.7843.243±1.1299.8980.005C69.561±1.56929.168±5.20811.232±5.26226.4860.000D618.240±6.63427.903±2.80618.530±1.6954.3600.059F10.32158.71421.180P0.0010.0000.000

3 討論

《類證治裁》記載:“肺為氣之主,腎為氣之根,肺主出氣,腎主納氣,陰陽相交,呼吸乃和。”說明腎臟在肺部疾病發生、發展過程中有著極其重要的影響。腎氣不足,攝納無權,肺之清氣不能肅降以下通于腎,氣之升降出入不利,肺腎兩虛,從而導致肺系疾病的急性發作或病情進展。因此腎臟在肺部疾病發生、發展過程中有著極其重要的影響。氣管切開插管易并發肺部疾病，既往我們研究發現補腎陽中藥淫羊藿水提取物可改善氣管切開大鼠免疫功能[3]。而中藥淫羊藿發揮作用的主要活性成分是以ICA為代表的黃酮苷類化合物及其體內代謝產物[5]。ICS-Ⅱ為ICA經腸道菌群代謝后產生的主要代謝產物之一。故本實驗基于ICA和ICS-Ⅱ探討淫羊藿對氣管切開大鼠發揮主要作用的有效成分。

細菌或病毒侵入機體后，可以引起體液免疫應答和細胞免疫應答，其中T細胞介導的細胞免疫應答在清除細菌或病毒等外源微生物中具有重要意義。T細胞根據其表達分子的不同可以分為CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T 細胞主要為輔助性T細胞(Th),又可分為Th1細胞和Th2細胞，其中Th2細胞可分泌IL-6、IL-10等細胞因子，主要為輔助體液免疫應答；而CD8+T細胞主要為抑制性T細胞和殺傷性T細胞,正常情況下,CD4與CD8細胞保持一定的比例,維持機體的細胞免疫功能。所以外周血CD4+和CD8+T細胞亞群的百分率以及CD4+/CD8+可作為評價機體免疫狀態的指標[6,7]。本實驗研究發現ICA和ICS-Ⅱ干預后，可明顯提高各組CD4+T細胞數量及CD4+/CD8+，ICS-Ⅱ可降低CD8+T細胞數量而ICA對其無明顯影響。表明ICA和ICS-Ⅱ可通過平衡各細胞亞群比例，提高CD4+/CD8+值，從而提高機體的免疫水平。且ICA效果優于ICS-Ⅱ，尤以168 h最顯著。

細胞免疫除了與T細胞亞群及其比例有關,細胞因子的變化也在其中發揮重要作用[8]。而細胞因子則有調控T細胞分化的功能[9]。IL-6是一種由T細胞、單核細胞、成纖維細胞等產生的多效細胞因子。Sean等[10]用伯氏疏螺旋體感染C3H小鼠,然后注射IL-6，發現IL-6可抑制Th1細胞的分化。本實驗研究發現，用ICA和ICS-Ⅱ干預后，C、D兩組外周血及肺泡灌洗液IL-6含量均明顯降低(P<0.05)。根據Sean等[10]研究提示，ICA和ICS-Ⅱ提高氣管切開大鼠外周血CD4+T細胞數量與CD4+/CD8+值的機制，可能與抑制外周血及肺泡灌洗液IL-6表達有關，從而起到抑制炎癥和增強細胞免疫的作用。

sIgA存在于體液免疫中,是呼吸道黏膜的主要保護性抗體,是黏膜免疫的第一道防線,可以阻止細菌和病毒吸附于上皮細胞表面不形成集落,發揮清除細菌、中和病毒和抑制病毒復制的作用[11]。Diebel等[12]向單核細胞中加入大腸桿菌和sIgA 并共同培養1 h,再與多形核中性粒細胞共培養,最后測定促炎因子IL-6、TGF-β和IL-8的含量。結果發現該方法與不加入sIgA 的培養方法相比,促炎因子 IL-6、TGF-β和IL-8的含量明顯降低。本實驗研究發現，用ICA和ICS-Ⅱ干預后，肺泡灌洗液sIgA含量明顯升高(P<0.05)，且ICA干預組在24 h、168 h兩個時段明顯高于ICS-Ⅱ干預組。結合Sean及Diebel等[10，12]研究結果可以推斷，ICA和ICS-Ⅱ可以通過促進肺泡灌洗液sIgA表達，抑制外周血及肺泡灌洗液IL-6表達，并改善T細胞亞群失衡，從而提高肺部免疫水平，同時減輕炎性反應，且ICA效果優于ICS-Ⅱ。

本實驗研究發現ICA對氣管切開大鼠提高免疫和減輕炎癥的效果優于ICS-Ⅱ，其機制可能與藥物本身活性有關，Cheng等[13]研究發現ICA和ICS-Ⅱ具有不同藥代動力學特性，具體藥理活性作用機制，有待進一步研究。