集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表達分析

張燕 岳壽松 陳高 游銀偉 鐘懷榮 于金慧

摘要：組蛋白乙酰基轉移酶上調表達與抗逆性有一定相關性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一個未知蛋白，預測其屬于組蛋白乙酰基轉移酶GNAT家族N-乙酰基轉移酶。為了進一步明確slr1501基因功能，本研究從集胞藻6803中克隆slr1501基因，成功構建了pET-28a（+）-slr1501原核表達載體，并轉化至大腸桿菌BL21（DE3）進行分析。經1 mmol/L IPTG誘導2 h后Slr1501蛋白成功表達，表達量隨誘導時間的延長而增加，且主要以包涵體形式表達。Western blot檢測結果顯示Slr1501重組蛋白特異性表達。本試驗結果為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：集胞藻6803; 乙酰基轉移酶; slr1501; 原核表達; 基因功能

中圖分類號：S555+.6：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）07-0001-05

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 （以下簡稱集胞藻6803）歸屬于藍藻門集胞藻屬，是一種單細胞藍藻，其基因組序列遺傳背景清楚、結構簡單，是基因工程研究的模式藻類。Slr1501是集胞藻6803中的一個未知蛋白，根據序列相似性和相應蛋白功能比對結果，預測其為組蛋白乙酰基轉移酶GNAT家族N-乙酰基轉移酶（http：//bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase）。組蛋白乙酰化由組蛋白乙酰基轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDAC）共同參與，過程動態可逆。組蛋白乙酰化是表觀遺傳調控的重要機制，在HAT的作用下，將乙酰基團轉移到目標受體氨基酸位點的過程，是細胞控制基因表達、蛋白質活性或生理過程的一種機制[1]。HAT對細胞核內轉錄調控因子的激活起到非常重要的作用，已證實乙酰化參與原核生物的轉錄后修飾，涉及轉錄調控和信號轉導蛋白[2]。

集胞藻6803 slr1501與逆境適應相關，如鹽脅迫、滲透脅迫、酸脅迫和堿脅迫等[3-7]。當轉至pH值為10條件下，集胞藻6803細胞中slr1501轉錄水平升高;而再次轉至中性pH值條件時，slr1501轉錄水平迅速下降至高pH條件時表達水平的1/40左右，1 h后，檢測不到slr1501的表達。這種快速的基因表達反應，目前尚未在其它pH逆境反應相關基因中發現[6]。slr1501可能在更大范圍的逆境適應中具有潛在作用，它的表達上調不僅只發生在pH值升高時，在高鹽、黑暗、冷脅迫、熱脅迫、缺鐵、缺氮、缺磷等逆境條件，特別是強光下上調最顯著[8]。但Taylor[7]的研究表明，在多重逆境（如高鹽、高光和高滲透壓）條件下，slr1501基因對集胞藻6803細胞生長具有負調控效應;在單逆境高pH條件下，缺失slr1501基因時，集胞藻6803細胞的生長不受影響。

目前，對集胞藻6803 slr1501的研究多停留在各種逆境條件下該基因的表達水平及抗逆反應上[3-7]，具體功能并未開展研究。基于此，本研究擬通過構建pET-28a（+）-slr1501表達載體，并在大腸桿菌中表達Slr1501蛋白，旨在為進一步研究該基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

集胞藻Synechocystis 6803基因組，本實驗室提取保存;pET-28a（+）載體，本實驗室保存;大腸桿菌DH5α和BL21 （DE3）感受態，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

DNA凝膠回收試劑盒、質粒回收試劑盒均購自OMEGA公司;限制性內切酶和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司;PCR擴增高保真酶和PCR檢測用酶均購自青島擎科梓熙生物技術有限公司;his tag兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗和ECL高靈敏度化學發光檢測試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 slr1501基因克隆

根據Cyanobase中集胞藻6803基因組序列，應用Primer Premier 5.0設計擴增slr1501基因全長引物：slr1501-NdeⅠ-F：5′-ACTCCATATGGTGATGTCAACCACGCTAAA-3′和slr1501-XhoⅠ-R：5′-ACTCCTCGAGTTAGTTGAGACGCATACCAA-3′，上下游引物5′端分別引入NdeⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點（下劃線處）。由青島擎科梓熙生物技術有限公司合成引物。

以集胞藻6803基因組DNA為模板，對slr1501基因進行擴增。PCR反應體系為50 μL：I5 PCR mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA 1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應程序：98℃ 2 min;98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s，35個循環;72℃ 5 min。

1.4 pET-28a（+）-slr1501載體構建和轉化

分別用NdeⅠ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切slr1501目的基因和 pET-28a（+）質粒，后經1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的基因和pET-28a（+）線性片段。經T4 DNA連接酶16℃過夜連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，Kan抗性篩選。挑取單克隆進行PCR和雙酶切驗證，并將陽性克隆送至青島擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

將測序正確的pET-28a（+）-slr1501質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態，用Kan抗性進行篩選，挑取陽性克隆進行菌落PCR驗證。

1.5 重組蛋白誘導表達

挑取含有重組質粒pET-28a（+）-slr1501的BL21（DE3）陽性菌落接種于5 mL含Kan抗性的LB液體培養基中，37℃振蕩（180 r/min）過夜培養。取培養過夜的菌液按照1∶100的接種量接種至新的含Kan抗性的LB液體培養基上，37℃振蕩培養2～3 h，至菌液OD600值達到0.6～0.8時，加IPTG（終濃度為1 mmol/L）開始誘導Slr1501蛋白表達，繼續振蕩培養，分別于誘導開始后0、2、4、6 h取 1 mL菌液離心收集菌體，加入100 μL的1% SDS，重懸菌體，70℃孵育10 min，后加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，混勻后于沸水中煮10 min，進行SDS-PAGE（12%分離膠，5%濃縮膠）電泳，90 V恒壓至樣品跑至分離膠內時，電壓調至120 V，直至蛋白電泳結束。收集誘導6 h的pET-28a（+）-slr1501菌液3 mL，離心后加1 mL PBS懸浮菌體進行超聲破碎，分別將上清和沉淀SDS-PAGE電泳，檢測誘導的Slr1501重組蛋白可溶性。