大腸桿菌持留菌株與抗藥菌株生長優勢的比較

胡明 付曉杰 張慶 齊靜 駱延波 李璐璐 劉玉慶

摘要：以64倍最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氨芐西林、環丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物分別處理大腸桿菌ATCC 25922，去除藥物后，保持原始菌株藥物敏感性的存活菌株為持留菌株;另用濃度遞增的亞致死量的三種抗菌藥物培養基連續對大腸桿菌ATCC 25922進行分批培養，獲得能夠耐受一定藥物濃度的抗藥性增強的菌株，去除藥物后，菌株穩定的MIC值仍顯著高于原始菌株，為抗藥菌株。以穩定的MIC范圍為檢測指標，比較原始菌株的持留菌株和抗藥菌株后續的生長優勢。結果表明：經過一段時間的混合培養，持留菌株在95%以上，數量上占絕對優勢，說明持留菌株比抗藥菌株具有更強的生長優勢，由此引發對抗藥性回復的重新思考，自然界中持留菌株的特性、形成及存在可能為抗藥性的逆轉預留了一條途徑。

關鍵詞：抗藥性;持留性;抗藥菌株;持留菌株;最小抑菌濃度（MIC）;生長優勢

中圖分類號：S852.61文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）07-0108-05

抗菌藥物的發現和使用大大降低了細菌感染性疾病導致的死亡率，但隨著抗菌藥物的廣泛應用，人類和動物病原菌的抗藥性問題凸顯并引起全球高度關注[1]。抗菌藥物使用之初就有相關抗藥性的報道，至今有關細菌抗藥性的起源、發展和傳播已有了相當的積累。研究表明細菌抗藥性可以通過多種機制產生，如編碼靶蛋白的基因突變、藥物滲透降低、細菌外排泵的外排功能激活、靶蛋白旁路、非酶的靶位保護、酶靶位修飾等，細菌通過整合各種可能的機制形成抗藥性表型，并且可遺傳的抗藥性能夠通過可移動遺傳因子進行水平轉移[2]，尤其在抗菌藥物選擇壓力下，越來越多的“超級細菌”逐漸產生，對人類健康造成巨大威脅[3]。

細菌的持留性（persistance）不同于抗藥性，表型上，持留菌雖然也能夠耐過遠高于MIC的藥物濃度得以存活，卻保留了原始菌株的藥物敏感特性。早在1944年，Bigger發現青霉素并不能完全殺死金黃色葡萄球菌，其中極小一部分可以存活，認為其表現為休眠狀態、非可遺傳表型[4]。抗菌藥物可以殺死大部分細菌，但總有一小部分不能被抗菌藥物殺滅，當這些存活的亞群在同樣的抗菌藥物條件下生長，會重復這種異質特性，這種現象叫做細菌持留性，存活的細菌叫做持留菌[5]。持留菌的形成機制尚不明確，目前已有的研究包括持留性相關基因如hipA[6]、毒素/抗毒素（TA）系統[7]和外排泵系統[8]等，與細菌抗藥性一樣，持留性也是多因素共同參與形成的。

持留菌和抗藥菌的本質和形成機制不同，但共存于抗菌藥物壓力下的細菌群體中。在對持留菌的研究中，普遍認為持留菌在抗藥性中起到了至關重要的“幫兇”作用，研究思路多為阻斷持留菌的形成和阻止進入休眠狀態[6-8]。而本文思路是從生態角度審視抗菌藥物使用過程中，休眠的持留菌在抗藥性回復中可能的作用及當去除藥物后二者在菌群后續繁殖中各自發揮怎樣的作用。在體外條件下采用氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素三種不同類型的常用抗菌藥物，以不同方式對原始菌株進行處理，獲得原始菌株的持留菌株和抗藥菌株，比較其藥敏特性和相同生態環境中的生長優勢，并探討持留菌存在的意義及其在抗藥性回復中潛在的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：藥物敏感性試驗質控菌株大腸桿菌ATCC 25922，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。

試劑與藥品：氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素，購自中國藥品生物制品檢定所，分析純;MH液體培養基（MHB）、MH固體培養基（MHA），購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 MIC測定 根據美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）建立的標準藥敏方法，采用微量肉湯稀釋法[9]，測定原始菌株、持留菌及抗藥菌株對氨芐西林、環丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.2.2 高藥物濃度下獲得持留菌株 用微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌ATCC 25922 MIC后，在96孔板上，將氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素的藥物濃度分別設置為各種藥物MIC的64倍（氨芐西林256μg/mL，環丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL），按照藥敏試驗方法的接種量接入穩定期大腸桿菌ATCC 25922，每種藥做18個重復孔，37℃靜置培養。分別于6 d內每天取3個重復樣，將每孔液體共200μL全部取出，10 000 r/min 離心5 min，用200μL生理鹽水洗滌2次，加50μL生理鹽水重懸后涂布MHA平板，培養24 ～?48 h，計算菌落數，測定MIC。

1.2.3 在遞增的亞致死量藥物濃度下分批傳代獲得抗藥菌株 取大腸桿菌ATCC 25922接種于裝有50 mL MHB的三角瓶中（接種量為1%，V/V），氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素的終濃度分別為各自的1/2 MIC，12 h后轉接到下一個三角瓶中（藥物濃度不變），培養12 h后再轉接到藥物濃度倍增的三角瓶中;藥物濃度由1/2 MIC連續倍比遞增至64倍MIC，每一濃度傳代2次，第二次培養細菌生長后劃線于含相同濃度藥物的MHA平板，過夜培養，挑取生長良好的單菌落并測定MIC。然后將其在無藥MHB中連續傳代直至MIC穩定，獲得一系列MIC穩定的抗藥性增強的菌株。

1.2.4 持留菌株與抗藥菌株的生長曲線測定 將獲得的原始菌的持留菌株和抗藥菌株在島津2500 UV-VIS光譜儀中37℃培養900 min，每15 min在線連續測量OD600，比較不同菌株的生長曲線是否存在差異。

1.2.5 持留菌株和抗藥菌株的MIC范圍 分別選取氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素三種藥物原始菌的持留菌株和抗藥菌株，挑取單菌落分別接種于等體積的MHB中，以同樣的條件振蕩培養16 ～?18 h，各取菌液1 mL稀釋至適當濃度，涂布于MHA平板獲得單菌落，各取100個單菌落進行MIC測定[9]，統計不同菌株各自的MIC分布范圍。

1.2.6 持留菌株和抗藥菌株生長優勢的比較 根據1.2.5中測定的MIC頻率分布結果，選取各自MIC范圍沒有交叉的持留菌株和抗藥菌株，等比例接種培養基混合培養，以各自MIC為檢測指標統計二者組成比例的變化。具體方法：挑取氨芐西林、環丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗藥菌株的單菌落，分別接種于MHB中，37℃、200 r/min振蕩培養12 h，用MHB稀釋，于紫外-可見光分析儀（GE Ultrospec 3100 pro）檢測OD600，調節至0.08 ～?0.10范圍內，盡量調整稀釋倍數使其最終達到相同的OD600值，確保小數點后兩位相同。以此濃度各取500μL，同時接種于含有100 mL MHB的三角瓶中，等比例接種后混合振蕩培養，每天取1 mL轉接入新的100 mL MHB中，連續轉移傳代7 d甚至更長時間。每次培養后取混合菌液稀釋至合適濃度，涂布獲得單菌落100株，測定其MIC。以1.2.5中測定的MIC頻率分布為指標，統計菌液中持留菌株和抗藥菌株來源的大腸桿菌的比例。

2 結果與分析

2.1 高藥物濃度下獲得持留菌株

在高藥物濃度的培養條件（氨芐西林256μg/mL，環丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL）下，持續作用6 d，依然能夠檢測到存活的細菌。按照接種量104 cfu/mL數量級計算，存活率在0.1%左右（表1）。此試驗結果表明，即使在有限的空間內，只要初始接種量達到一定數量，高于致死濃度的抗菌藥物并不能完全殺死細菌，總會有一小部分細菌存活下來。

在藥物氨芐西林濃度為256μg/mL條件下，先后共收集存活的細菌134株，測定其MIC，90%以上的菌株與原始菌株持平，少數略高于原始菌株一個或兩個梯度，均遠遠低于其生存環境的藥物濃度。環丙沙星和多粘菌素作用下的群體也存在同樣的現象（數據略）。這些在高濃度藥物作用下存活的細菌，其MIC卻保持不變，為持留菌。致死量的抗菌藥物不能將其殺滅，說明持留菌通過某種機制耐過了高濃度的藥物，并且保持了原有的藥物敏感特性。隨機選取其中一株氨芐西林的持留菌，在氨芐西林濃度為256μg/mL的環境中得以存活，測定其分裂繁殖的后代實際MIC為4μg/mL，經傳代后MIC保持不變，命名為菌株P-A，是原始菌株持留菌株繁殖后代的純培養。

用同樣的方法獲得環丙沙星和多粘菌素作用下的持留菌株，分別耐過的藥物濃度為1μg/mL和32μg/mL，保持原始菌株的MIC分別為0.0156μg/mL和0.5μg/mL不變。

2.2 在遞增的亞致死量藥物濃度下傳代獲得抗藥菌株

在藥物選擇壓力不斷提高的試驗條件下獲得一系列抗藥性增強的菌株，能夠在相應藥物濃度下繼續生長繁殖。這些菌株的MIC值遠遠高于原始菌株MIC。由于存在多種形成機制，在藥物去除后有些抗藥機制關閉，而有些抗藥機制是穩定的，因此，在無藥培養基中連續傳代后，抗藥菌株的MIC值有不同程度的回落，但都難以回復到原始菌株的敏感性。

經遞增的亞致死量氨芐西林連續培養后，選取一株MIC穩定的耐過氨芐西林256μg/mL的抗藥菌株，傳代后MIC穩定在128μg/mL，是原始菌株MIC的32倍，命名為R-A。

用同樣的方法獲得環丙沙星和多粘菌素的抗藥菌株，選取耐過1μg/mL環丙沙星和32μg/mL多粘菌素的抗藥菌株，穩定的MIC分別為0.5μg/mL和8μg/mL。

2.3 持留菌株和抗藥菌株的MIC范圍

MIC值表示菌株對藥物的敏感程度，是一個群體概念。由于細菌群體具有異質性，純培養的細菌群體中小亞群的MIC也可能有所差異。因此，MIC并非一個準確的數值，而是一個范圍。為了后續比較生長優勢，先檢測各類菌株的MIC范圍，分別取100個單菌落測定MIC分布情況。氨芐西林藥物處理的菌株MIC統計結果如表2，P-A的MIC分布峰值為4μg/mL，MIC與原始菌株持平;R-A的MIC分布峰值為128μg/mL，是原始菌株MIC的32倍。經過傳代培養證明，兩個菌株的MIC范圍是穩定的表型指標，可以作為判定菌株性質的指標。對環丙沙星和多粘菌素處理菌株的穩定MIC范圍也按同樣的方法進行統計（數據略）。

2.4 持留菌株和抗藥菌株生長優勢的比較

經檢測，不同藥物作用下篩選的兩類菌株的生長曲線并無明顯差異（生長曲線圖略），因此可采取混合培養的方式，以各自MIC為衡量指標比較其生長優勢。

氨芐西林處理的P-A和R-A菌株MIC范圍無相互交叉，將二者等比例混合接種培養，根據穩定的MIC范圍統計其比例變化。如圖1所示，混合培養后，持留菌株P-A所占比例逐漸升高，到第4 d增至70%以上，至第7 d抗藥菌株R-A比例低于5%，菌株P-A數量占絕對優勢。此結果表明，在沒有藥物的培養條件下，P-A具有更強的生長優勢。隨機挑選氨芐西林作用下存活的其它持留菌株和抗藥菌株，用同樣的方法對比其生長優勢，也有類似的結果（數據略）。另外兩種藥物環丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗藥菌株，生長優勢的比較也存在類似結果（數據略），最終都能體現出持留菌株具有更強的生長優勢。本研究中共檢測8組菌株的對比，未檢測到例外情況。

3 討論與結論

3.1 細菌抗藥性的意義

抗菌藥物的廣泛應用是篩選與富集抗藥菌株的主要推動力，卻并非抗藥性產生的根源[10]。抗藥基因廣泛而普遍地存在于環境中—病原菌、共生菌及多種環境微生物[11]。越來越多的研究表明，抗藥性是細菌的一個自然屬性[12]，徹底消除抗藥性是不可能的。由于細菌遺傳物質的自發突變、藥物壓力的篩選和誘導、復雜多樣的抗藥性機制、不可避免地與周圍環境微生物接觸等眾多因素，即使在有限的空間內和特定條件下也難以完全消除細菌抗藥性。從另一個方面看，抗藥性對于細菌本身而言則意味著物種能夠克服環境抗菌藥物壓力得以延續和存活，對環境微生物群落結構的多樣性和穩定性起到了重要作用，對動物（包括人）免疫系統的形成、健康乃至整個生態環境都具有重大影響[13，14]。

細菌的抗藥性為菌株提供了額外的生物學特性，幫助提高微生物對特定環境的適應性，同時多數情況下會付出一定的抗性代償，包括生長繁殖能力降低。因此，理論上原始菌株比抗藥菌株具有更強的生長優勢，但在抗菌藥物壓力下具有更強生長優勢的原始敏感菌被殺死，而抗藥菌株的敏感性回復則是復雜漫長的過程[15]。

3.2 持留菌的存在及在抗藥性回復中的潛力

在林林總總的抗藥表型和抗藥機制中，持留菌以其獨特的機制引起人們的注意。持留菌通過“休眠-恢復生長-增殖”的方式維持自身的生存和菌體結構穩定，巧妙躲過外界惡劣環境的影響而存留下來，但依然保持著原始菌株的特性。比較持留菌株與抗藥菌株的生長優勢，可引發對抗藥性回復問題的重新思考。本文研究結果表明當去除抗菌藥物壓力后，抗菌藥物壓力下存活的持留菌株比抗藥菌株具有更強的生長優勢，這一結論尚未見其它類似文獻。雖然持留菌的作用尚未經過全面驗證，但面對生態中嚴峻的抗藥性問題，持留菌的存在和特性還是提供了一線希望。在環境中抗菌藥物壓力不斷增大的過程中，存留了一批批“沉睡”的“種子”——持留菌。當藥物壓力逐漸降低，人們對于抗藥性水平降低的期待不僅停留在抗藥菌株的敏感性恢復[10]，也在于預留的持留菌“蘇醒”并恢復活力，以更為原始的菌株特性與現存的抗藥性細菌共同競爭，而多數抗藥性細菌可能由于其抗性代償而處于劣勢。只有環境中菌群的抗藥性水平整體回落才能根本解決抗藥性問題，并非對抗藥菌斬盡殺絕，也非阻斷所有抗藥性機制。本研究結論表明，持留菌的存在和形成機制保留了原始菌株的生長優勢，隨著抗菌藥物使用水平的降低，可能在抗藥性的逆轉中起到一定作用。

參 考 文 獻：

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