北五味子多糖的分離純化及其對雞外周血淋巴細胞的影響

董雯雯 林樹乾 李桂明 趙增成 黃中利 傅劍 殷斌 劉月月 賈鳳娟 楊世發(fā)

摘要：本研究在傳統(tǒng)水提醇沉法基礎上輔以酶消化法提取北五味子多糖，并用離子凝膠柱層析法對其進一步純化，分離得到三種分子量的多糖組分（SCP-Ⅰ、SCP-Ⅱ和SCP-Ⅲ）。為分析多糖三種組分對雞外周血淋巴細胞的作用，首先用高濃度（最高10 mg/mL）的三種多糖組分作用于淋巴細胞，結(jié)果顯示≤1 mg/mL的多糖對細胞沒有顯著的毒性作用。以不同濃度的三種SCP組分（0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0μg/mL）作用于淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)SCP-Ⅲ對細胞因子IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌具有顯著的增強作用，但最佳作用濃度不同，SCP-Ⅰ和SCP-Ⅱ?qū)@三種細胞因子的作用效果不顯著。本研究為北五味子多糖的精制和應用奠定了理論基礎。

關鍵詞：北五味子;多糖;分離純化;雞;淋巴細胞;細胞因子

中圖分類號：S853.7文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）07-0117-04

五味子為木蘭科五味子[Schisandra chinensis（Turcz.） Baill]的干燥成熟果實，是我國傳統(tǒng)中草藥，含有木脂素、多糖、揮發(fā)油等多種活性成分，其多糖成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗疲勞和抗腫瘤等多種生物活性[1-3]。五味子資源豐富，其中北五味子中的多糖含量比南五味子豐富，其水提得率高達10%以上[4，5]，具有多糖提取應用的基礎。

五味子多糖（Schisandra chinensis polysaccharide， SCP）的體外活性研究發(fā)現(xiàn)，SCP可顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性，促進脾細胞的增殖，提高免疫抑制小鼠的淋巴細胞活性[6]。初步藥理研究表明，SCP作用于正常小鼠，可增加免疫器官指數(shù)，增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對India Ink的吞噬能力，并顯著提高正常小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率，促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化[7];SCP作用于免疫抑制小鼠，能顯著對抗環(huán)磷酰胺（CTX）所致小鼠外周血白細胞的減少，拮抗由環(huán)磷酰胺引起的T淋巴細胞增殖抑制，并增加免疫抑制小鼠胸腺和脾臟重量，具有顯著的免疫增強作用[8，9]。

本研究對北五味子進行提取、分離、純化，將分離到的多糖組分作用于雞外周血淋巴細胞，分析其對雞外周血T淋巴細胞活性和細胞因子的影響，為該多糖的進一步應用和研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對所用北五味子購自濟南建聯(lián)中藥店;無特定病原（SPF）雞購自山東昊泰繁育有限責任公司;細胞因子檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;CCK8購自索萊寶公司;RPMI1640細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自GIBCO公司;其它常用化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 北五味子多糖的分離提取

北五味子多糖的提取采用傳統(tǒng)水提醇沉法進行，并結(jié)合酶消化法除蛋白以提高多糖的提取效率[10]。具體步驟如下：用粉碎機將北五味子打磨成粉，用濾紙分成數(shù)包并放入索氏提取器中，乙醚抽提脂肪。將除去脂肪的北五味子粉與去離子水混合后加入胃蛋白酶充分反應，隨后置于85℃浸提，并用0.1%的活性炭除色素雜質(zhì)。靜置沉淀后過濾，再離心取上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加壓濃縮。隨后用無水乙醇沉淀粗多糖，將沉淀相繼用乙醇、丙酮和乙醚洗滌，冷凍干燥后即得到粉末狀北五味子多糖，最后采用苯酚-硫酸法檢測所得SCP純度[11]。

1.3 北五味子多糖的純化

將上述提取的SCP重新溶解，取1 mL溶液沿管壁緩慢加入到已平衡好的Sephadex G-200凝膠柱（700 mm × 15 mm），以0.2 mL/min的流速用0.1 mol/L NaCl洗滌，每管收集間隔為5 min，用餾分自動收集器進行收集，將洗脫峰的洗脫液裝入透析袋進一步濃縮（截流分子量為7 000 D），最后經(jīng)乙醇沉淀，冷凍干燥得到純化多糖組分。

1.4 雞外周血淋巴細胞的分離與培養(yǎng)

采用成年SPF雞一只，翅靜脈采抗凝血1 mL，抗凝血與全血稀釋液1∶1混勻后，緩慢加于2 mL細胞分離液的液面上，以4℃、1 500 r/min離心15 min，此時離心管中由上至下分四層：血漿液層、環(huán)狀乳白色淋巴細胞、透明分離液層、紅細胞層。收集第二層細胞放入含細胞洗滌液4～5 mL的試管中，充分混勻后，以1 500 r/min離心10～30 min。沉淀經(jīng)反復洗2次即得所需淋巴細胞。臺盼藍檢測細胞活力，然后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞稀釋為1×106/mL，以每孔100μL接種到96孔板，置于37℃、5% CO2孵育培養(yǎng)。

1.5 多糖對淋巴細胞的毒性檢測

淋巴細胞培養(yǎng)2 h后棄去上層培養(yǎng)液，加入混合不同濃度（0、10、100、1 000、5 000、10 000μg/mL）多糖組分的培養(yǎng)液孵育培養(yǎng)24 h，加入10μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后在450 nm處測定吸光度，確定各多糖組分的毒性作用。

1.6 多糖對淋巴細胞分泌細胞因子的影響

淋巴細胞培養(yǎng)2 h后棄去上層培養(yǎng)液，加入混合不同濃度（0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0μg/mL）SCP的培養(yǎng)液孵育培養(yǎng)16～48 h至淋巴細胞鋪滿底部，取上清，用ELISA試劑盒檢測上清中IFN-γ、IL-2和IL-6濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 北五味子多糖的分離提純

采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，用標準葡萄糖系列溶液繪制標準曲線，以吸光度值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，濃度與吸光度值呈良好的線性關系，回歸方程為：y=0.014x，R2=0.9963。檢測結(jié)果表明，北五味子多糖的提取率達到5.61%，多糖的純度為91.18%。