DENV-2作用于HUVECs和人巨噬細(xì)胞對黏附分子表達(dá)的影響①

羅 玉 左 麗 來 濤 張 妮 周恩正 陳俊豪

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,貴陽 550025)

登革病毒(Dengue virus，DENV)直徑40～60 nm，是單股正鏈RNA病毒，長度約11 kb，屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種在熱帶和亞熱帶地區(qū)由埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播的常見的蟲媒病毒[1-3]。在過去二十年間，全球每年大約有39億人感染DENV，其中大約10億人產(chǎn)生癥狀，DENV感染可引起自限性的登革熱(Dengue fever，DF)、重癥登革熱出血(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)，重癥DF疾病的典型臨床表現(xiàn)為血管滲漏、血小板減少癥和輕度至中度的肝損傷，體液流失過多導(dǎo)致血液濃縮和低血壓，進(jìn)而引起死亡[4]。DENV感染所導(dǎo)致的死亡率、發(fā)病率和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的重要威脅，重要的是這些癥狀的出現(xiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂有一定關(guān)系[5]。

根據(jù)已知報(bào)道，DENV有4種血清型(DENV-1～4)。DENV基因可編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(E、PrM、C)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，其中NS1是一種48 kD的糖蛋白，表達(dá)在細(xì)胞表面并且可以分泌進(jìn)入DF患者血液[6,7]。另外，DENV NS1蛋白也涉及增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透[8]。而與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)的免疫應(yīng)答不適引起的血漿滲漏是重癥DF的病理生理特征,并且內(nèi)皮細(xì)胞的激活、炎性介質(zhì)釋放對血管的滲透和細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附有一定關(guān)系[9]。

DENV主要是在人固有免疫細(xì)胞中復(fù)制，巨噬細(xì)胞是DENV致病機(jī)制中的重要靶細(xì)胞[6]，其釋放趨化因子和細(xì)胞因子，并認(rèn)為可激活內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管通透性，并且巨噬細(xì)胞在病毒繼發(fā)感染期間起著重要作用[10]。

細(xì)胞黏附分子在免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)中起著重要的作用，黏附分子主要涉及白細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)并與其內(nèi)皮細(xì)胞上的受體相互作用，在免疫系統(tǒng)中促進(jìn)細(xì)胞黏附[11]。一般認(rèn)為細(xì)胞間黏附分子(Intercellular adhesion molecule,ICAM)-1、血管黏附分子(Vascular adhesion molecule,VCAM)-1、內(nèi)皮選擇素(Endothelium selectin,E-selectin)在慢性炎癥中起著重要作用，并認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞紊亂的標(biāo)志[12]。本研究通過建立DENV-2感染HUVECs和人巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，來探究其對黏附分子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 DENV-2標(biāo)準(zhǔn)株(NGC株)由本課題組保存。白紋伊蚊細(xì)胞C6/36細(xì)胞株購自中科院昆明細(xì)胞庫。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Primary human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自美國Sciencell公司。

1.1.2濃縮白細(xì)胞濾盤血 經(jīng)貴州省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)和貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意，由貴州省血液中心提供。

1.1.3試劑和儀器 ECM培養(yǎng)基(含ECGs)(美國Sciencell公司)；人淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞裂解液(北京Solarbio公司)；RPMI1640 培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)(BI公司)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)(美國PeproTech公司)；EasyPure RNA 提取試劑盒(北京全式金公司)；Anti-Human CD11b APC(Invitrogen公司)；Anti-human CD14 FITC(美國BD公司)；Human sICAM-1、sVCAM-1和sE-selectin Platinum ELISA試劑盒(Invitrogen公司)；倒置顯微鏡(Nikon)；RT system (Bio-Rad，CFX96)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI-STEPONE PLUS)。

1.1.4基因引物序列 各基因堿基序列由上海生工合成，見表1。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) C6/36細(xì)胞用RPMI1640 培養(yǎng)基(含10%FBS)，于28℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合至90%時(shí)用胰酶消化傳代；HUVECs細(xì)胞用ECM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%ECGS)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合至約90%時(shí)用胰酶消化傳代。

1.2.2DENV-2的鑒定與毒力檢測 用稀釋度10-8～10-1的DENV-2病毒液感染C6/36細(xì)胞2 h,PBS潤洗3次，用RPMI1640(含2%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)3～6 d，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)計(jì)算DENV-2對C6/36 細(xì)胞的組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)。C6/36細(xì)胞生長至90%時(shí)，用103TCID50 DENV-2病毒液感染細(xì)胞2 h后，PBS潤洗3次，換RPMI1640(含2%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，待細(xì)胞出現(xiàn)病變，收集細(xì)胞提取RNA，PCR擴(kuò)增NS1部分序列，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目標(biāo)條帶。

表1 相關(guān)基因引物序列

Tab.1 Primer sequence of related gene

GenePrimer(5′ to 3′)Length(bp)NS1F:AACCTATTGATGGTCCCGAAA413R:CCAAGATGGATTTGATTTCTGCTTANS1(q-PCR)F:AACAACTACTGCCTCTGGAAAACTC90R:CATCCGTCCTCACCTCTGTATCTICAM-1F:CAGTGA CCATCTACA GCTTTCCGG119R:GCTGCTACCACAGTGATGACAAVCAM-1F:GATACAACCGTCTTGGTCAGCCC89R:CGCATCCTTCAACTGGGCCTTE-selectinF:TGGAACACAACCTGTACATTTG85R:AATTCCCAGATGAGGTACACTGβ-actinF:GCATGGGTCAGAAGGATTCCT106R:TCGTCCCAGTTGGTGACGAT

1.2.3單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的提取與轉(zhuǎn)化 將用生理鹽水稀釋的濃縮白細(xì)胞濾盤血液緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液表面，通過水平密度梯度離心(2 000 r/min，20 min，室溫)分離提取白膜層，紅細(xì)胞裂解液處理5～7 min后，用含2%FBS的PBS潤洗3次，離心(1 500 r/min，7 min，室溫)棄液后所得細(xì)胞沉淀即為PBMC，用RPMI1640培養(yǎng)基(含1%FBS)重懸后貼壁2 h，棄去上清，換含10%FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基，加終濃度為1 ng/ml M-CSF，培養(yǎng)5～7 d。

1.2.4巨噬細(xì)胞的鑒定 棄上清，PBS潤洗3次，胰酶消化細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至流式管中，300 μl PBS重懸細(xì)胞，加20 μl anti-human CD14 FITC和5 μl anti-human CD11b APC，室溫避光染色1 h上機(jī)。

1.2.5共培養(yǎng)體系的建立 取對數(shù)期生長的細(xì)胞HUVECs接種于Transwell 6孔板的下室，3×105個(gè)/孔，培養(yǎng)48 h；將巨噬細(xì)胞接種于上室，3×106個(gè)/孔，用 RPMI1640培養(yǎng)基(含1%FBS)貼壁2 h；加入103TCID50 DENV-2的病毒液為實(shí)驗(yàn)組，無病毒液為對照組，孵育2 h，PBS潤洗3次，換含10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6qRT-PCR 分別于4、8、12、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，EasyPure RNA Kit試劑盒提取細(xì)胞RNA，檢測RNA純度和濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，β-actin作內(nèi)參，通過SYBR Green染料法檢測目的基因DENV-2 NS1、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的相對表達(dá)量。

1.2.7雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的動(dòng)態(tài)變化 分別收集各時(shí)間點(diǎn)各組培養(yǎng)上清液，并將空白組和等比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品移至ELISA板，100 μl/孔，加入Conjugate液,50 μl/孔，室溫避光1～2 h,棄液拍干，Wash Buffer潤洗3次后棄液拍干，加入100 μl/孔TMB底物顯色液，室溫避光15 min，迅速加入100 μl/孔終止液于450 nm波長檢測吸光度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，統(tǒng)計(jì)方法采用兩因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DENV-2的鑒定與毒力檢測 DENV-2感染C6/36細(xì)胞3～6 d內(nèi)，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、融合、空泡、網(wǎng)絡(luò)狀的典型細(xì)胞病變。通過RT-PCR擴(kuò)增DENV-2 NS1部分基因序列，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳于 250～500 bp之間出現(xiàn)一明亮條帶(圖1)，與預(yù)期相符，證實(shí)為DENV-2。記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算DENV-2的滴度為10-5.5/0.1 ml。

圖1 DENV-2部分序列擴(kuò)增Fig.1 Partial sequence amplification of NS1Note: 1.Marker;2.PCR production of DENV-2.

2.2巨噬細(xì)胞的鑒定 提取并分離PBMC，核細(xì)胞經(jīng)刺激因子衍生為巨噬細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定純度為(92.15±1.24)%(圖2)。

2.3qRT-PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)HUVECs和巨噬細(xì)胞及共培養(yǎng)后HUVECs 中病毒載量 DENV-2感染HUVECs后，NS1 mRNA相對表達(dá)量呈先增加后降低趨勢(圖3A)，24 h(1.25±0.16)達(dá)峰值且比4 h感染組增加了(1.44±0.17)倍(P<0.05)。DENV-2感染巨噬細(xì)胞后，NS1 mRNA相對表達(dá)量呈先遞減后增加趨勢(圖3B)。感染的HUVECs與感染的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，其HUVECs的NS1 mRNA相對表達(dá)量均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)HUVECs單獨(dú)感染組，在24 h(19.78±2.63,P<0.000 1)、48 h(10.67±0.65,P<0.000 1)顯著上調(diào)(圖4)。

2.4qRT-PCR 檢測不同時(shí)間點(diǎn)DENV-2感染的巨噬細(xì)胞中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA相對表達(dá)量 DENV-2感染巨噬細(xì)胞后，ICAM-1 mRNA相對表達(dá)量于4 h(2.09±0.01，P<0.000 1)、8 h(2.04±0.01，P<0.000 1)高于巨噬細(xì)胞未感染組，12 h(0.92±0.03)、24 h(1.03±0.01)、48 h(0.97±0.04)、72 h(0.84±0.06)相對表達(dá)水平與未感染組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A)，E-selectin mRNA相對表達(dá)量于4 h(5.65±1.51，P<0.000 1)明顯高于未感染組，8 h(1.45±0.21)與未感染組相比表達(dá)量相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12 h(0.15±0.03)、24 h(0.14±0.04)、48 h(0.19±0.06)、72 h(0.24±0.09)與未感染組相比表達(dá)量下調(diào)(圖5B)，但未檢測到VCAM-1 mRNA的表達(dá)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測M-CSF刺激后巨噬細(xì)胞的比例Fig.2 Flow cytometry to detect proportion of macroph-ages induced by M-CSFNote: A.Unstained cells;B.Stained cells.

圖3 NS1 mRNA不同時(shí)間點(diǎn)相對表達(dá)量Fig.3 NS1 mRNA relative expression in HUVECs and macrophages at different timeNote: A.NS1 mRNA in HUVECs；B.NS1 mRNA in macrophages.Compared with uninfected group at the corresponding time,#.P<0.05,##.P<0.01，###.P<0.001，####.P<0.000 1；compared with infected group of 4 h，**.P<0.01，****.P<0.001.

2.5qRT-PCR 檢測不同時(shí)間點(diǎn)HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA相對表達(dá)量 DENV-2感染HUVECs后，各時(shí)間點(diǎn)ICAM-1、VCAM-1 mRNA均有表達(dá)，共培養(yǎng)組在8 h后表達(dá)量相比HUVECs單獨(dú)感染組上調(diào)，且均在24 h達(dá)峰值，分別為(6.60±0.20，P<0.000 1，圖6A)、(2.48±0.18，P<0.000 1，圖6B)。DENV-2感染HUVECs后， 4 h(1.20±0.08)E-selectin mRNA表達(dá)量最高，共培養(yǎng)組呈先增加后遞減趨勢且表達(dá)均上調(diào)(圖6C)。

圖4 HUVECs中DENV-2 NS1 mRNA不同時(shí)間點(diǎn)相對表達(dá)量Fig.4 DENV-2 NS1 mRNA relative expression in HUVECsNote: Compared with infected-HUVECs at the corresponding time,****.P<0.000 1.

圖5 DENV-2感染的巨噬細(xì)胞中ICAM-1和E-selectin mRNA相對表達(dá)量Fig.5 ICAM-1 and E-selectin mRNA relative expression in DENV-2-infected macrophagesNote: A.ICAM-1 mRNA in macrophages，B.E-selectin mRNA in macrophages.Compared with uninfected group at the corresponding time,####.P<0.000 1.

2.6雙抗體夾心ELISA法檢測HUVECs中黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin 在不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化 DENV-2感染的HUVECs與未感染的HUVECs組相比，在相同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)的ICAM-1水平均無明顯變化，共培養(yǎng)組中感染DENV-2的HUVECS表達(dá)ICAM-1水平在8 h(91.63±0.57)最高，未被感染的HUVECs表達(dá)ICAM-1水平呈先增加后減少趨勢，在24 h(92.85±0.24)達(dá)峰值(圖7A)。DENV-2感染的HUVECs組，其表達(dá)E-selectin水平隨時(shí)間呈逐漸遞增，且在72 h(6.07±0.39，P<0.000 1)表達(dá)量最高；共培養(yǎng)組中感染DENV-2的HUVECs，其表達(dá)E-selectin水平隨時(shí)間呈先遞增后降低趨勢，且在24 h(6.12±1.03，P<0.000 1)表達(dá)量達(dá)峰值(圖7B)。但未檢測到各組培養(yǎng)上清液中VCAM-1分子的表達(dá)。

圖6 HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA不同時(shí)間點(diǎn)相對表達(dá)量Fig.6 ICAM-1，VCAM-1 and E-selectin mRNA relative expression in HUVECsNote: Compared with infected-HUVECs at the corresponding time,*.P<0.05，***.P<0.001,****.P<0.000 1.

圖7 雙抗體夾心ELISA法檢測HUVECs表達(dá)ICAM-1和E-selectin的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 ELISA to detect expression of ICAM-1 and E-selectin in HUVECsNote: H.HUVECs；DV.DENV-2；C-H.co-cultured HUVECs;DV-infected HUVECs compared with uninfected HUVECs，*.P<0.000 1;DV-infected HUVECs compared with uninfected HUVECs in co-cultured group.#.P<0.000 1.

3 討論

DENV感染后引起DHF和DSS的病理機(jī)制尚不完全清楚，但內(nèi)皮細(xì)胞通常作為研究DENV致病機(jī)制的重要細(xì)胞。DHF的典型癥狀表現(xiàn)為血管滲透，有研究表明許多炎癥因子和血管生成介質(zhì)增加血管蛋白對小靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)皮的滲透作用[13]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞因子在DHF的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其患者的血管滲透與血漿中各種細(xì)胞因子的水平升高有關(guān)[8]。然而，一般而言，組織的損傷程度與病情嚴(yán)重程度并不十分一致[14]，另外，短暫性的血漿滲漏和DSS兒童患者的快速恢復(fù)都表明滲透性的改變受可溶性介質(zhì)的影響[15]。

在PBMC的存在下，內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加，其滲透性增加可能部分原因是由于DENV感染PBMC時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞因子[16]，DENV可在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞樣細(xì)胞系中復(fù)制并誘導(dǎo)細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性因子。有研究報(bào)道，在體外，DENV感染的PBMC能激活內(nèi)皮細(xì)胞并介導(dǎo)黏附分子的釋放，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加[17]。在本次實(shí)驗(yàn)中，DENV-2感染HUVECs和人巨噬細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)均能檢測到NS1 mRNA表達(dá)，在24 h其相對表達(dá)量達(dá)峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且被DENV-2感染的HUVECs在各時(shí)間點(diǎn)均有黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA的表達(dá)。而細(xì)胞黏附因子是一類能夠介導(dǎo)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子與血管內(nèi)皮細(xì)胞等相互作用的糖蛋白，作為黏附分子家族成員之一的E-selectin可以介導(dǎo)白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的滾動(dòng)和黏附，而牢固的黏附和向內(nèi)皮下組織的遷移由免疫球蛋白超家族成員，包括ICAM-1和VCAM-1的參與[18]。本研究中，DENV-2感染的巨噬細(xì)胞，在4、8 h 其ICAM-1和E-selectin mRNA相對表達(dá)量明顯高于未感染組，但未檢測到VCAM-1 的表達(dá)，說明DENV-2能夠激活巨噬細(xì)胞，但不能有效地刺激VCAM-1的表達(dá)。另外，將感染DENV-2的巨噬細(xì)胞添加到感染DENV-2的HUVECs中，內(nèi)皮細(xì)胞中病毒RNA拷貝數(shù)在24 h和48 h明顯增加，這可能與DENV-2感染活化的巨噬細(xì)胞促炎作用有關(guān)，這些巨噬細(xì)胞是由單核細(xì)胞衍生而來。且在共培養(yǎng)組中檢測到12 h后，DENV-2感染的HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA相對表達(dá)量均明顯高于單獨(dú)感染的HUVECs，在各時(shí)間點(diǎn)均能檢測到培養(yǎng)上清液中可溶性分子ICAM-1和E-selectin的表達(dá)，說明DENV-2感染的巨噬細(xì)胞可能增強(qiáng)DENV-2感染的HUVECs的細(xì)胞活化，使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的黏附分子維持在較高水平，從而引起白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附的改變，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞局部炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致血管的屏障功能受損，從而促進(jìn)血管滲漏的發(fā)生。

本次研究證明在DENV-2感染的巨噬細(xì)胞與HUVECs的共培養(yǎng)體系下，活化的巨噬細(xì)胞在一定時(shí)效內(nèi)能增強(qiáng)DENV-2在內(nèi)皮細(xì)胞中的復(fù)制作用并促進(jìn)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)。部分報(bào)道認(rèn)為是單核細(xì)胞能導(dǎo)致DENV感染的內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白表達(dá)減少，黏附分子表達(dá)增加，細(xì)胞間出現(xiàn)多個(gè)間隙，導(dǎo)致滲漏增加[19,20]，但目前對于DENV-2感染后，內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相互作用對黏附分子的影響了解更少，本研究為今后繼續(xù)探討DENV感染的免疫病理機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。