補腎活血方對URSA患者外周血中IL-12和IFN-γ影響的臨床研究①

馮曉玲 賈 丹 劉慶麗 張 楊

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱 150040)

復發性流產是指與同一個配偶連續發生2次及以上的自然胚胎丟失或停止發育[1]。本病的病因復雜，除遺傳因素、子宮畸形和子宮肌瘤等解剖學因素、內分泌因素、生殖道感染因素、免疫因素、血栓形成傾向以及環境因素外，另外還有大約40%的患者病因不明，稱為不明原因復發性流產(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。隨著對本病認識的深入，研究發現免疫因素是導致URSA發生的直接因素，其中Th1/Th2失衡是導致本病發生的主要原因[3]。祖國醫學對本病有了更深入的認識，補腎活血法治療URSA患者也取得了顯著的臨床療效，本文通過臨床研究,探討補腎活血方對URSA患者外周血中IL-12和IFN-γ的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1URSA患者 2016年2月～2017年2月期間就診于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院URSA患者61例作為研究對象，排除患有精神疾病不能完成治療及患有肝腎功能異常、風濕等全身系統疾病，兩組病例年齡及孕周比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。患者年齡23～41歲，平均年齡(30.75±4.02)歲，停經周數為6～8周。分為補腎活血方聯合地屈孕酮31例(URSA-1)，其中治療期間1例未按要求治療，和單用地屈孕酮30例(URSA-2)。

1.1.2URSA妊娠失敗患者 2016年2月～2017年2月期間就診于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院的URSA妊娠失敗患者15例作為實驗組(URSA-3),納入標準為年齡22～42歲，妊娠<12周者，符合早期URSA西醫診斷標準及中醫腎虛血瘀證證候診斷標準而未經任何治療URSA流產者。排除標準為不符合納入病例標準者，如胚胎染色體核型分析異常和病因明確者。患者年齡23～40歲，平均年齡(32.33±4.74)歲，停經周數為6～10周，正常妊娠人工流產患者15例作為對照組(Control)，納入標準為患者年齡和妊娠周數同上并且為正常妊娠，無自然流產史，有一次或一次以上正常生育史，既往生育子女均健康，夫妻無遺傳病史，此次妊娠狀況良好，實驗室指標及超聲正常，要求進行人工流產患者。排除標準為首次妊娠婦女；有保胎意愿；胚胎染色體核型分析異常者；實驗室指標及超聲有異常者。年齡29～41歲，平均(33.80±3.74)歲，孕周范圍為6～10周。本研究已獲得倫理委員會批準，并在獲得患者知情同意后，收集患者蛻膜組織。

1.2方法

1.2.1給藥方式 URSA-1患者給予補腎活血方聯合地屈孕酮口服治療4周。URSA-2患者單獨給予地屈孕酮口服治療4周。中藥補腎活血方，藥物如下:丹參15 g，菟絲子15 g，續斷15 g，桑寄生15 g，阿膠(烊化)10 g，黃芪15 g。根據患者情況隨證加減，日一劑200 ml水煎服，早晚分服，以上中藥湯劑均由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥局及煎藥室提供。地屈孕酮片:10 mg，口服2次/d，從住院開始服用，服用4周。地屈孕酮片(達芙通，荷蘭Abbott Healthcare Products BV公司)國藥準字H20130110，規格10 mg/片。

1.2.2ELISA檢測 URSA-1組和URSA-2組患者入組前以及入組4周后均采血，統一應用ELISA法檢測患者血清中IL-12、IFN-γ的水平。使用Human IL-12 ELISA試劑盒和Human IFN-γ ELISA kit試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司)，具體操作步驟均按照試劑盒步驟進行。

1.2.3RT-PCR檢測 分別收集URSA-3組和Control組早孕期婦女行人工流產的蛻膜組織，用RT-PCR方法檢測兩組患者蛻膜組織中的IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR mRNA的表達量。TRizol購自Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase購自Promega公司。RT-PCR使用2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(BIOTOOL)。具體操作步驟按照說明書進行。實驗結果采用比較Ct法定量，2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。ΔCt =Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt待測樣品-ΔCt對照組。將逆轉錄得到的完整cDNA模板進行RT-PCR擴增，以此設定的程序運行RT-PCR儀，由此得出擴增曲線。

1.2.4妊娠結局與隨訪情況比較 截止2018年1月，剔除本研究中脫落的患者，對其余患者進行電話隨訪調查，URSA-1組有1例患者在妊娠32周左右時產檢發現胎盤老化住院治療，治療后分娩一名健康胎兒；2例患者在妊娠14周左右出現陰道流血不止，發生難免流產，胎兒做染色體核型分析均未見異常。余皆無明顯不適，分娩健康胎兒中，Apgar評分8～10分。URSA-2組有3例患者妊娠14周左右，發現胎兒停止發育，妊娠約12周；2例患者妊娠15周左右出現陰道流血量增多，腹痛不止，發生難免流產；3例患者妊娠21周左右行超聲檢查，發現無胎心，胎兒做染色體核型分析均未見異常；余皆分娩健康胎兒，Apgar評分8～10分。

2 結果

2.1URSA-1組和URSA-2組患者血清中IL-12、IFN-γ的水平

2.1.1外周血中IL-12標準曲線 ELISA法測定兩組臨床患者血清中IL-12水平，與標準品對照后吸光度曲線如圖1、表1所示。

2.1.2外周血中IFN-γ標準曲線 ELISA法測定兩組臨床患者血清中IFN-γ水平，與標準品對照后吸光度曲線如圖2、表2所示。

2.2URSA-3組和Control組患者流產蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR組擴增曲線 我們通過RT-PCR法測定URSA組與Control組流產蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR的含量，使用軟件繪制出各項觀測指標的擴增曲線(圖3、4)。

GroupsnBefore treatmentAfter treatmenttPURSA-13041.65±11.4532.52±9.071)12.1010.000URSA-23043.82±11.70 37.71±10.472)3)10.2000.000

Note：Compared with the URSA-1 before treatment,1)P<0.01；compared to the URSA-2 before treatment,2)P<0.01；compared with the URSA-1 after treatment,3)P<0.01.

圖2 URSA-1組和URSA-2組患者血清中IFN-γ水平曲線圖Fig.2 Serum IFN-γ level curve in URSA-1 group and URSA-2 group patients

GroupsnBefore treatmentAfter treatmenttPURSA-13037.87±9.4727.92±7.641)3.9030.000URSA-230 39.68±10.1233.08±8.892)3)2.7450.000

Note：Compared with the URSA-1 before treatment,1)P<0.01；compared to the URSA-2 before treatment,2)P<0.01；compared with the URSA-1 after treatment,3)P<0.01.

圖3 URSA-3組和Control組患者流產蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IFN-γR擴增曲線Fig.3 Amplification curves of IL-12Rβ1，IL-12Rβ2 and IFN-γR in decidua tissue of abortion in URSA-3 group and Control groupNote: nt is the control group,ut is the URSA group.

圖4 GAPDH擴增曲線Fig.4 GAPDH amplification curvesNote: nt is the control group,ut is the URSA group.

表3 URSA-3組與Control組蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12 Rβ2和IFN-γR mRNA相對表達量

Tab.3 Relative expression of IL-12Rβ1，IL-12Rβ2 and IFN-γR mRNA in decidua tissues of URSA-3 group and Control group

GroupsnIL-12Rβ1 mRNAIL-12Rβ2 mRNAIFN-γR mRNAControl150.69±0.270.59±0.160.62±0.16URSA-3151.81±0.291.13±0.250.99±0.22P0.0000.0070.000

表4 URSA-1組和URSA-2組臨床妊娠結局比較

Tab.4 Total clinical efficacy of URSA-1 group and URSA-2 group

GroupsnLive birth babyabortionTotal effective rate(%)URSA-13028293.3URSA-23022873.3

2.3URSA-3與Control組蛻膜IL-12Rβ1、IL-12β2、IFN-Rγ mRNA表達比較 兩組URSA患者的蛻膜組織中，URSA-3組中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-Rγ mRNA表達均高于Control組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4妊娠結局及隨訪情況比較 總療效如表4所示，兩組相比臨床保胎成功率差異具有顯著統計學意義(P<0.05)，說明URSA-1組與URSA-2組相比，臨床療效更好。

3 討論

近年來生殖免疫學的研究越來越深入，免疫因素在生殖中發揮著至關重要的作用，而且發現URSA的發生可能與母胎界面間免疫耐受機制相關，是免疫排斥的結果。URSA這種病理性妊娠可能是因為細胞因子的分泌異常或者母胎界面局部細胞功能異常引起的。

正常妊娠期，母體的各項機能都會發生相應變化，尤其是免疫功能方面，包括特異性的免疫抑制、抑制性T細胞和非特異性因子維持正常妊娠。這種環境一旦被打破，母體就會對胎兒產生免疫排斥，進而可能引起妊娠失敗[4,5]。近年來，學者們對URSA的生殖免疫學因素進行了諸多研究，發現與免疫相關的復發性流產可以分為自身免疫型和同種免疫型，同種免疫型又稱原因不明型。同種免疫型URSA與母胎界面免疫耐受不平衡具有相關性，同種免疫型URSA的原因包括Th1與Th2細胞因子的失衡、封閉抗體低下、NK細胞活性及亞型表達異常、CD4+CD25+調節性T淋巴細胞表達異常等。調節性T細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞型,表達CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞的亞型起源于胸腺[6]，在機體的免疫耐受和調控免疫應答中發揮不可忽視的作用[7]。妊娠期間胎兒所攜帶的抗原能夠被母體的抗原呈遞細胞所識別，并呈遞給特定的CD4+T細胞，CD4+T細胞受到刺激后分化為Th1、Th2、Th17和調節性T細胞，從而在母胎界面形成特定的免疫微環境。Th1型細胞因子主要介導細胞免疫反應,產生胚胎排斥作用；Th2細胞因子主要促進抗體生成和介導體液免疫，起到抗炎性反應的作用，對Th1細胞有抑制作用，故對妊娠有利。Th1/Th2細胞因子網絡調控這兩種免疫應答，其過程和方式錯綜復雜。相關文獻報道，流產的發生與Th1/Th2的偏移密切相關，正常妊娠需要Th1/Th2保持平衡，打破這種平衡，將導致URSA的發生[8,9]。Th1型細胞主要分泌IL-2、 IL-12、TNF-α等細胞因子，Th2型細胞主要分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-4、 IL-6等因子[10]。

IL-12是一種由淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和其他抗原呈遞細胞產生的通過二硫鍵將分子量35 kD(P35)和40 kD(P40)兩個亞基結合組成的一種細胞因子，是白介素家族中的一員。IL-12與其受體(IL-12Rβ1和IL-12Rβ2兩個鏈構成的異二聚體)之間具有很高的親和力。P40亞單位是可溶性的蛋白，且為誘導性表達，與免疫細胞表面對應的受體IL-12Rβ1相結合；而P35亞基為組成性低水平表達，與對應的受體IL-12Rβ2相結合并產生免疫傳導信號。IL-12有多種生物活性，在機體炎性反應早期和感染時期即可產生，其中最主要的生物學特性是調節Th細胞亞群的平衡。IL-12是連接抗原特異適應性免疫與先天免疫應答的關鍵因子，在細胞免疫應答的過程中起調節作用，并且可以誘導細胞免疫排斥反應。國內外研究證明，IL-12水平的異常與URSA的發生具有相關性[11,12]。

研究者在1965年發現白細胞培養上清液中有IFN樣抗病毒物質，另一團隊在1973年于淋巴細胞培養上清液中也發現干擾素存在，1980年將其命名為IFN-γ。IFN-γ主要由活化的T細胞及NK細胞產生，亦屬于Th1型細胞因子，可以抑制Th2細胞增生。相關研究證明，URSA患者外周血中IFN-γ水平相比于正常未孕婦女明顯升高。IFN-γ導致流產可能通過以下多種途徑，一方面促進Th0向Th1細胞分化，激活 NK細胞的殺傷毒性；另一方面，能夠促進免疫應答反應，使胎盤細胞發生凋亡，同時能促使滋養細胞表面黏附分子的表達，損傷滋養細胞的生長發育[13,14]。

本研究結果表明，URSA患者蛻膜組織中IL-12R及IFN-γR的含量明顯高于正常早孕人流組。說明二者的異常表達可能通過改變蛻膜組織中細胞因子的作用，進一步影響母胎界面免疫耐受及Th1/Th2的平衡，導致流產[15，16]。提示IL-12、IFN-γ可能與URSA的發病相關。用ELISA法對分別用補腎活血方聯合地屈孕酮及單純地屈孕酮治療的兩組URSA患者治療前后外周血中的IL-12、IFN-γ水平進行測定，結果發現，治療后URSA患者外周血中IL-12、IFN-γ水平明顯降低，并且補腎活血方及地屈孕酮聯合用藥療效明顯優于單純地屈孕酮組，為補腎活血治療URSA臨床應用提供了參考依據。

本實驗檢測蛻膜組織IFN-γR和IL-12R mRNA表達水平,今后我們的研究方向應增加檢測治療前外周血中IL-12與IFN-γ水平的臨床部分，并分析細胞因子與蛻膜組織靶細胞膜表面相關受體作用的相關性。同時擴大樣本量，減少地域因素帶來的影響，以達到減少誤差的效果，并進行多因素分析，設計相關的動物實驗，深入研究蛻膜組織中的IL-12、IFN-γ水平及導致URSA的機制，彌補不足。對患者進行遠期隨訪，完善兒童智力、生長發育狀況等方面的資料，為補腎活血方長期廣泛應用于臨床治療URSA提供依據。