NLR及ESE-3轉錄因子在胃癌患者中表達及其與預后的關系

李玲玲 楊俊娥 石慶芳 杜秋越 王大慶 周風舉

(1哈勵遜國際和平醫院腫瘤科，河北 衡水 053000；2天津市中心婦產科醫院病理科)

胃癌是最常見的上消化道惡性腫瘤，2015年癌癥統計數據〔1〕顯示，我國胃癌患者67.9萬例，僅次于肺癌，且死亡率極高，我國胃癌死亡人數占全球同期胃癌總死亡40%以上〔2〕，為社會及家庭帶來嚴重的疾病負擔。ETS超家族是一個轉錄調控因子家族，在腫瘤演進過程中發揮重要作用〔3〕，上皮轉錄調控因子(ESE)-3轉錄因子作為 ETS 家族的一員，主要調控基因表達，ESE-3在胰腺癌、卵巢癌中作為抑癌因子，抑制腫瘤細胞的增殖〔4,5〕，在甲狀腺癌中則作為促癌基因直接作用于HER2和 HER3結合位點，促進腫瘤的進展〔6〕。ESE-3表達異常與胃癌關系如何，國內外相關報道很少。此外，中性粒細胞和血小板積極參與腫瘤進展和轉移過程，中性粒細胞淋巴細胞比值(NLR)和血小板與淋巴細胞比率(PLR)與多種惡性腫瘤預后密切相關〔7〕，但關于胃癌術后預后相關研究較少。本研究分析胃癌組織ESE-3、CD133及NLR、PLR與患者臨床病理特征相關性，再探討NLR及ESE-3轉錄因子對胃癌患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1病例來源 選擇2011年5月至2013年5月哈勵遜國際和平醫院初次行胃癌根治術患者82例，研究對象均符合納入標準。納入標準：①初次行胃癌根治術；②術后病理組織確診為胃癌，根據國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會(UICC/AJCC)胃癌 TNM 分期標準(2010)進行術前分期；③患者及家屬了解并簽署之情同意書。排除標準：①術前未進行化療；②術前合并嚴重感染或免疫性疾病；③年齡大于75歲。術后通過復診、電話、郵件等形式進行隨訪，隨訪時間終點為術后5年，隨訪終點時間為患者死亡，以隨訪結束或術后至死亡作為患者生存時間，本研究已通過醫院倫理委員會倫理審查。

1.2研究方法 免疫組化SP檢測法：取胃癌病灶及距原發灶邊緣 5 cm 以上的正常胃黏膜組織，標本送病理科石蠟包埋，熟練切片厚度為5 μm，切片放恒溫箱收集備用，經脫蠟水化放入EDTA修復液灰盒，在高壓鍋中加熱到噴氣1.5 min，取出后放入 3%的過氧化氫溶液中，室溫避光10 min，經PBS溶液洗滌3 次，每次5～10 min，將一抗用抗體稀釋液稀釋，ESE-3抗體(Abcam 公司，英國)及CD133 抗體(Miltenyi 公司，德國)稀釋后，次日復溫后滴加二抗 ，37℃孵育30 min后，加 PBS洗滌3次每次5～10 min，滴加新配置的二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察直至顏色變為黃褐色，蘇木精復染2～5 min，脫水，透明，使用中性樹膠封片。有棕褐色或棕黃色著色顆粒記為陽性。隨機選取觀察區域內5個高倍視野，每個高倍視野計數500個細胞，其陽性細胞百分比<5%者判為陰性，≥5%為陽性。研究對象術前1 w內采集靜脈血2 ml，進行血常規檢測，包括淋巴細胞計數、中性粒細胞計數、血小板計數等，計算NLR及PLR。以 NLR<4 為低NLR組，NLR≥4 為高NLR組；PLR<195為低PLR組，PLR≥195為低PLR組〔8〕。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法制作生存曲線，組間生存曲線比較采用Log-rank檢驗。

2 結 果

2.1ESE-3、CD133在胃癌及癌旁組織中的表達 胃癌組織中ESE-3陽性表達為81.7%(67/82)，顯著高于癌旁組織(54.9%，45/82)，差異有統計學意義(χ2=13.629,P=0.000)，陽性顆粒主要定位于細胞核中。胃癌組織中CD133陽性表達為51.2%(42/82)，癌旁組織均為陰性，兩組差異具有統計學意義(χ2=56.459,P=0.000)。

2.2ESE-3、CD133表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 胃癌組織ESE-3表達陽性率與患者TNM分期及浸潤深度明顯相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移無相關(P>0.05)；胃癌組織CD133表達陽性率與患者腫瘤分化程度、TNM分期及浸潤深度明顯相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移無相關(P>0.05)，見表1。

表1 ESE-3、CD133陽性表達與患者臨床病理特征的相關性(n,n=82)

2.3NLR、PLR與胃癌患者臨床病理特征的關系 胃癌患者NLR高水平與患者分化程度、TNM分期及浸潤深度明顯相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移無相關(P>0.05)；胃癌患者PLR高水平與患者腫瘤分化程度、TNM分期及浸潤深度明顯相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移無相關(P>0.05)，見表2。

表2 NLR、PLR與患者臨床病理特征的相關性(n,n=82)

2.4NLR及ESE-3轉錄因子與胃癌患者臨床預后的關系 胃癌組織中ESE-3轉錄因子表達陰性患者其術后生存情況顯著優于ESE-3表達陽性患者(P<0.05)，見圖1；NLR低水平患者其術后生存情況顯著優于NLR高水平患者(P<0.05)，見圖2。

圖1 ESE-3表達與胃癌患者臨床預后的關系

圖2 NLR與胃癌患者臨床預后的關系

3 討 論

早發現早治療是減少胃癌死亡率的最有效措施。近年來，胃癌相關生物學標志物研究為其預防和治療提供了重要依據，其中ETS超家族已被證實在細胞增殖分化、凋亡及腫瘤形成過程中起著至關重要的作用〔9〕。ESE-3轉錄調控因子屬于 ETS超家族的 ESE亞家族，廣泛存在于細胞核內，能夠單獨或與其他效應分子形成轉錄復合物，抑制或增強不同下游靶基因轉錄。大約85%的腫瘤是由腺上皮組織中基因異常表達導致上皮細胞增殖和分化缺陷發展而來，ESE-3在上皮或在富含腺上皮組織中表達異常促進了腫瘤的發生、發展〔10〕。在結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中，ESE-3是一種潛在的腫瘤抑制基因，其在癌組織中表達明顯低于癌旁組織〔11〕；而在甲狀腺癌中證實ESE-3上調頻繁，增強了癌細胞增殖及運動性和侵襲能力。本研究結果顯示，胃癌組織ESE-3陽性表達高于癌旁組織，可能是胃癌新的轉錄因子。Shi等〔12〕發現敲低胃癌細胞ESE-3表達可顯著抑制ETS蛋白質的關鍵靶點基質金屬蛋白酶家族基因的表達，此外，下調胃癌細胞ESE-3表達可降低her2～4 mRNA表達，抑制其下游MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路活性酶家族來促進胃癌的發生。因此，ESE-3可能成為胃癌預后判斷新指標，為基因治療提供新靶點。

腫瘤發生發展與機體炎癥細胞和免疫信號密切相關〔13〕，其中中性粒細胞、淋巴細胞和血小板尤為重要。腫瘤細胞通過調節炎癥基因釋放促炎因子和趨化因子，抑制細胞免疫并促進癌細胞生長；中性粒細胞通過生成多種炎癥介質，促進腫瘤血管形成及轉移擴散，并減弱自然殺傷細胞功能，促使腫瘤細胞免疫逃逸。 淋巴細胞是抗腫瘤免疫主要細胞，淋巴細胞數量減少為腫瘤細胞增殖及惡性侵襲提供了條件。NLR可反映腫瘤患者炎性反應和免疫反應平衡狀態，高水平NLR 有利于腫瘤細胞增殖轉移，Zhao等〔14〕通過回顧性分析378 名惡性腫瘤患者NLR與臨床病理特征及生存率的關系，發現NLR 為進展期惡性腫瘤患者預后的獨立危險因素。PLR則反映與腫瘤細胞相關的炎癥反應，腫瘤細胞增殖誘導IL-1、IL-6水平增加，致使血小板過度增生，進而釋放因子促進腫瘤細胞生長。本研究發現胃癌患者NLR及PLR 水平與年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移無關，與腫瘤分化程度、TNM分期及浸潤深度有關，且低水平NLR胃癌患者生存期優于高水平患者。這可能與機體免疫和炎癥反應失衡，腫瘤細胞浸潤轉移增加，抑制腫瘤細胞增殖作用減弱有關，Sun等〔15〕通過回顧性分析305例胃癌根治術患者NLR、PLR等相關指標，認為其能有效評價患者總生存率；Lee等〔16〕研究顯示NLR和PLR 是晚期胃癌化療患者預后的獨立危險因素。因此，胃癌根治術患者術后監測NLR及PLR 水平，在一定程度上可反映其預后水平。

綜上所述，NLR及ESE-3表達與胃癌發生發展及預后密切相關，ESE-3可能是胃癌一種潛在的預后標志物和治療靶點。但ESE-3在胃癌組織中上調，促進胃癌發展的機制有待進一步研究，為臨床藥物治療提供新的思路。