基于金屬硫蛋白銅納米簇的過氧化物酶活性檢測尿酸

劉然,左利,劉士蒙,楊桂英,李詩雅,呂昌銀

(南華大學 公共衛生學院,衡陽市健康危害因子檢驗檢疫新技術研究重點實驗室,湖南 衡陽 421000)

尿酸是嘌呤核苷酸分解代謝的終產物[1],人體血清中尿酸水平的正常范圍為130～460 μmol/L[2]。尿酸異常是嘌呤代謝相關疾病的反映[3]。目前,人血尿酸的檢測方法主要有高效液相色譜法、電化學法和熒光法等,這些方法雖然都較靈敏,但儀器昂貴、操作復雜[4]。當前,仍需進一步開發靈敏簡便、成本低廉的尿酸檢測新技術。

本研究利用尿酸氧化酶選擇性催化尿酸氧化產生H2O2后,用金屬硫蛋白銅納米簇(MT-CuNCs)的類過氧化物酶活性催化H2O2與色源底物3,3-二氨基聯苯胺(DAB)進行顯色反應,實現比色/光度法準確檢測人血清尿酸。該方法簡便靈敏、選擇性好、成本低廉,能夠滿足實際應用需要。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

金屬硫蛋白銅納米簇,自制；尿酸、尿酸酶、3,3-二氨基聯苯胺(DAB)、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙酸鈉均為分析純；超純水(電阻率18.25 MΩ·cm)。

UV-2550紫外-可見分光光度計,狹縫1 nm(用于獲取體系的吸收光譜)。

1.2 MT-CuNCs的制備

取600 μL 2.25 mg/mL金屬硫蛋白溶液,置于100 μL 3 mol/L氯化銅溶液中,55 ℃恒溫,振蕩混勻15 min后,加入1.0 mol/L NaOH溶液200 μL,持續恒溫混勻12 h。溶液顏色從淺藍色變為淺紫色。制備所得的MT-CuNCs經0.2 μm濾膜過濾后,在4 ℃冰箱內避光保存。

1.3 實驗原理

尿酸氧化酶特異性催化尿酸氧化產生H2O2[5],MT-CuNCs具有類過氧化物酶活性,可催化其表面的H2O2生成·OH[6]。強氧化性的·OH氧化DAB形成棕色的DBTD聚集體[7]。在一定濃度范圍內,可通過測定體系顏色深淺或465 nm處的吸光度值的變化定量檢測尿酸濃度。

圖1 比色/光度法測定尿酸的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the principle of colorimetric/photometric determination of uric acid

1.4 尿酸的檢測

在一系列2 mL的EP管中,依次加入80 μL 10 mmol/L pH=7.0 Tris-HCl緩沖液,再分別加入不同量的尿酸溶液,70 μL 200 μg/mL尿酸酶溶液,混合均勻后孵育30 min使其充分反應,產生H2O2。隨后,依次加入100 μL 200 mmol/L pH=5.0 NaAc-HAc,40 μL MT-CuNCs,40 μL 5 mmol/L DAB,混勻,在37 ℃下恒溫孵育30 min后,在λe=465 nm處分別測定加入了尿酸各溶液的吸收光譜(A),測定未加入尿酸溶液的吸收光譜(A0),計算吸收光譜的變化值ΔA=A-A0。

2 結果與討論

2.1 光譜特征

由圖2可知,DAB溶液對400 ～ 650 nm的光無吸收；在UOx+MT-CuNCs+DAB測定體系中不存在尿酸,MT-CuNCs通過其氧化酶活性,催化溶液中的溶解氧氧化DAB,但催化氧化能力弱,產生的DBTD少,棕色聚集體量少,吸光度值增加,但變化小。在UA+UOx+MT-CuNCs+DAB測定體系中,由于存在尿酸,尿酸氧化酶特異性催化尿酸氧化產生H2O2,MT-CuNCs的類過氧化物酶活性,催化其表面的H2O2生成強氧化性的·OH,對DAB的氧化能力強,將DAB氧化產生棕色聚集體,吸光度值增加,變化大。H2O2+MT-CuNCs+DAB測定體系A-λ曲線與UA+UOx+MT-CuNCs+DAB測定體系的A-λ曲線具有相同的輪廓和吸收峰,驗證了MT-CuNCs對DAB-H2O2氧化反應的催化行為,證明MT-CuNCs具有過氧化物酶活性,能夠催化DAB顯色。據文獻報道,通過465 nm處的吸光度值變化可判斷DAB的氧化程度[8]。據此,本文制備金屬硫蛋白銅納米簇后,研究建立了比色/光度法檢測尿酸的新方法。

圖2 不同體系的紫外可見吸收光譜圖Fig.2 UV-visible absorption spectrum of the difference system

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 尿酸氧化體系的優化 考察了Tris-HCl緩沖溶液的pH和用量對尿酸氧化體系A值的影響,結果見圖3。

圖3 Tris-HCl緩沖液的pH值和用量對 測定體系ΔA值的影響Fig.3 Effect of pH value and volume of Tris-HCl buffer solution on ΔA value of determination system

由圖3可知,pH=7.0時,體系的ΔA值最大；當緩沖液用量為100 μL時,體系的ΔA值最大。因此,選擇加入100 μL pH=7.0的Tris-HCl緩沖液進行后續實驗。

尿酸氧化酶的濃度影響H2O2的釋放,從而影響DAB的氧化速率。由圖4可知,當尿酸酶用量為70 μL時,H2O2的釋放量達到最大,故加入70 μL 200 μg/mL尿酸酶催化尿酸氧化。

圖4 尿酸酶用量的影響Fig.4 Effect of the concentration of uricase

進一步考察尿酸氧化的反應溫度和反應時間的影響,結果見圖5。

圖5 尿酸氧化反應溫度(A)及反應時間(B)的影響Fig.5 Effect of reaction temperature (A) and reaction time (B)on uric acid oxidation reaction

由圖5A可知,反應溫度在20～37 ℃時,隨著溫度的升高,體系吸光度變化值也隨之增大；當反應溫度達到37 ℃后,溫度過高,尿酸氧化酶的催化活性被破壞,體系的ΔA值逐漸降低,選取37 ℃作為尿酸氧化的反應溫度。尿酸酶催化尿酸氧化生成H2O2需要一定的反應時間,由圖5B可知,尿酸孵育30 min時ΔA最大,這說明尿酸酶催化尿酸氧化生成產生H2O2在30 min時基本反應完全。

2.2.2 MT-CuNCs催化DAB顯色體系的優化 考察了PBS、Tris-HAc、NaAc-HAc等緩沖溶液對 MT-CuNCs催化DAB顯色體系的影響,結果見圖6。

圖6 緩沖體系類型的影響Fig.6 Effect of buffer system type

由圖6可知,在NaAc-HAc緩沖溶液中,體系的ΔA值最大,故選擇NaAc-HAc緩沖液進行實驗。

對緩沖溶液的pH值和用量進行了優化,結果見圖7。

圖7 NaAc-HAc緩沖液的pH和用量的影響Fig.7 Effect of the pH and volume of NaAc-HAc buffer solution

由圖7A可知,pH=5.0時,體系的ΔA值最大；在pH值過高下,H2O2不穩定,會分解成H2O和O2,導致氧化DAB的能力下降；pH值過低時,DAB的顯色反應可能被抑制。由圖7B可知,當緩沖液的用量為100 μL時,體系的ΔA值最大。因此,選取100 μL pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液作為最佳實驗條件。

在MT-CuNCs催化DAB顯色反應體系中,銅納米簇是發揮HRP催化功能的物質,其用量對反應體系吸光能力的影響至關重要。由圖8可知,當納米簇的用量在10 ～ 40 μL時,體系ΔA值隨納米簇的用量增加而升高；當納米簇的用量超過40 μL后,體系吸光度ΔA值隨其用量增加反而降低,因此,選擇40 μL作為本實驗中納米簇的用量。

圖8 MT-CuNCs用量的影響Fig.8 Effect of the concentration of MT-CuNCs

對DAB的用量進行了優化,結果見圖9。

圖9 DAB用量的影響Fig.9 Effect of the concentration of DAB

由圖9可知,當DAB的用量在20～40 μL時,體系ΔA值隨DAB的用量增加而升高,但超過40 μL后,體系ΔA值隨DAB的用量增加反而降低。這可能是因為DAB氧化速率依賴于DAB濃度,即顯示在低DAB濃度下隨著DAB增加氧化速率增加,并且在DAB濃度較高時顯著抑制速率。根據文獻報道,DAB濃度較高時聚合物生成速率增加,將會捕獲體系內的活性催化位點,這阻礙了空間內H2O2或DAB單體的輸送[9]。不僅如此,當DAB濃度太高時,體系內形成不溶的淺棕色沉淀,影響測定。因此,選擇40 μL作為本實驗中DAB的用量。

在上述實驗條件優化的基礎上,對DAB顯色體系的反應溫度和反應時間進行優化,結果見圖10。

由圖10A可知,20～35 ℃時,隨著反應溫度的升高,體系ΔA值隨之升高；但反應溫度超過 37 ℃之后,隨著溫度的升高,體系的ΔA值反而下降。當溫度過低時,DAB的顯色反應緩慢進行,而溫度過高時,H2O2自分解。由圖10B可知,當反應時間達30 min時,體系的ΔA值達到最大,DAB氧化反應基本完成。因此,實驗選擇在37 ℃下反應30 min后測定。

圖10 DAB顯色反應溫度(A)和時間(B)的影響Fig.10 Effect of (A) temperature and (B) time of DAB color reaction

2.3 共存物質影響

選擇性對傳感器來說至關重要,在上述優化實驗條件下,考察葡萄糖(Glu)、甘氨酸(Gly)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)以及血清中常見的離子(Na+、K+、Mg2+、Zn2+)對尿酸傳感器的影響,結果見圖11。

圖11 干擾物質的影響Fig.11 Effect of interference substance

由圖11可知,當相對誤差控制在±10%時,50倍的Glu、Na+、K+,25倍的Mg2+、Gly、Lys、Zn2+、Pro不干擾測定,這表明建立的方法具有良好的抗干擾性。

2.4 標準曲線、檢出限和相對標準偏差

在優化的條件下,考察了ΔA值與尿酸濃度之間的關系,結果見圖12。

由圖12可知,當尿酸的濃度在25～750 μmol/L時,ΔA值與尿酸濃度之間呈現良好的線性關系,線性回歸方程為ΔA= 0.31CUA(mmol/L)+0.01,相關系數r=0.998。平行測定空白溶液11次,依據LOD=3sb/k(sb為空白溶液測定的標準偏差,k是標準曲線的斜率)計算,檢出限為7.72 μmol/L。對75,375,625 μmol/L的尿酸溶液分別進行11次平行測定,其相對標準偏差分別為4.62%,3.02%,3.53%。

圖12 ΔA值與尿酸濃度的關系Fig.12 Relationship between ΔA value and uric acid concentration and corresponding coloriogram

2.5 樣品測定與加標回收率

通過靜脈穿刺獲得3份志愿者的血液樣品。先將15%三氯乙酸與血液樣品按3∶1的比例充分混合15 min后,將混合物以10 000 r/min離心10 min[10]。準確吸取40 μL上清液,按照所建立的方法進行測定,結果見表1。

表1 人血清樣本中尿酸的檢測結果(n=6)Table 1 Detection of uric acid in human serum samples (n=6)

由表1可知,該方法簡單易行,準確度良好。

3 結論

本研究成功建立了尿酸生物傳感檢測新方法。MT-CuNCs具有過氧化物酶活性,對DAB-H2O2氧化反應具有催化行為,能夠催化DAB溶液顯色。尿酸檢測濃度范圍為25～750 μmol/L,檢出限7.72 μmol/L,可以滿足實際血液樣品中尿酸的測定分析。本方法既可以通過裸眼比色法半定量血樣中尿酸濃度,也可以通過分光光度法準確測定其含量,簡便易行,抗干擾性良好。