蔬菜中四環(huán)素和土霉素含量測定的快速前處理方法

崔詩瑤,李婧,蘇玉紅

(新疆大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830046)

隨有機(jī)肥施用進(jìn)入農(nóng)田[1]或隨污水排放進(jìn)入水域[2],抗生素可通過植物吸收作用進(jìn)入食物鏈中[1]或影響環(huán)境微生物進(jìn)化[3],造成人體健康和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[4]。植物中抗生素含量測定的樣品前處理方法眾多[5],其中Oasis Hydrophilic-lipophilic balanced (HLB)固相萃取(SPE)法廣受歡迎[6]。但此法提取時(shí)需多次轉(zhuǎn)換溶劑,且Oasis HLB SPE柱價(jià)格昂貴。因此,本文以蔬菜中檢出率較高的OTC[7]和TC[8]為目標(biāo)抗生素,以水溶液為提取劑,以分子印跡聚合物為富集凈化填料[9-10],意圖通過優(yōu)化條件,建立一種快速、廉價(jià)、高效的蔬菜中抗生素含量測定樣品前處理方法,為建立蔬菜中抗生素的自動(dòng)監(jiān)測技術(shù)提供一定思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

白菜,購自新疆大學(xué)新園市場；7種蔬菜樣品,從新疆烏魯木齊市郊某蔬菜基地中現(xiàn)場采集(先后用自來水和蒸餾水洗凈置于室內(nèi)風(fēng)干,在45 ℃下烘48 h后粉碎備測)；鹽酸土霉素(OTC,97%)、四環(huán)素鹽酸鹽(TC,98%)均為市售；乙腈為色譜純；甲醇、鹽酸(36%～38%)、磷酸均為分析純。

KQ5200E超聲波清洗器；TBL80-2B離心機(jī)；LC-20A高效液相色譜儀配備紫外-可見檢測器；SHB-III循環(huán)水式多用真空；PHS-3C精密pH計(jì)；FDY2002-SUV超純水儀；SHA-82水浴恒溫振蕩器；JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Oasis HLB固相萃取柱(6 mL/200 mg)。

1.2 溶液配制

1.2.1 兩種抗生素儲(chǔ)備液的配制 分別稱取適量TC和OTC標(biāo)準(zhǔn)品,以甲醇為溶劑配制100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,避光冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酸化乙腈溶液的配制 以250 mL乙腈中添加2 mL鹽酸的比例配制提取液備用。

1.2.3 不同pH值溶液的配制 使用適量鹽酸配制的水溶液(pH值分別為2.0,3.0,4.0,5.0)作為提取液備用。

1.3 色譜條件

Spursil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈：0.01 mol/L磷酸水溶液(20/80,V/V)；流速1 mL/min；溫度30 ℃；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 樣品的前處理

1.4.1 樣品前處理方法 稱取10.000 0 g白菜勻漿于50 mL 離心管中,加入10～30 mL 不同pH的水靜置同化10 h,然后進(jìn)行振蕩-超聲-離心-過濾提取,將上清液用自制含有MIPs的濾頭進(jìn)行富集3次。富集完成后,濾頭用甲醇∶乙酸=9∶1(V/V)的混合液洗脫,將洗脫液用溫和的氮?dú)獯抵两?用甲醇定容至0.1 mL后以微孔有機(jī)濾膜(0.22 μm) 過濾待測。

1.4.2 方法的加標(biāo)回收率 稱取10.000 0 g白菜勻漿加入50 mL的離心管中,平行11份,其中2份作空白,剩余9份加入兩種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(每個(gè)濃度平行3份),然后按優(yōu)化出的最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定。計(jì)算不同加標(biāo)濃度下的回收率。

1.4.3 固相萃取法(Oasis HLB柱萃取)樣品前處理 準(zhǔn)確稱取10.000 0 g白菜勻漿加入50 mL的離心管中,加入15 mL酸化乙腈溶液振蕩5 min-超聲細(xì)胞破碎(5 s/次10次,400 W)-離心20 min-過濾,殘?jiān)蒙鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取2次,合并上清液。往清液中加入2 mL去離子水,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)至2 mL左右,先用去離子水稀釋濃縮液至50 mL,再通過固相萃取小柱富集后用甲醇洗脫,將洗脫液用氮吹濃縮后,用甲醇定容至1 mL,溶液過0.22 μm濾膜待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式的影響

考察了不同提取方式對(duì)白菜中抗生素回收率的影響,分別按以下方案進(jìn)行提取：①振蕩10 min-離心20 min-過濾；②振蕩10 min-超聲10 min-離心20 min-過濾；③振蕩5 min-超聲細(xì)胞破碎(5 s/次10次,400 W)-離心20 min-過濾；④振蕩10 min-超聲細(xì)胞破碎(5 s/次10次,400 W)-離心20 min-過濾；⑤超聲細(xì)胞破碎(5 s/次10次,400 W)-離心20 min-過濾。提取后回收率結(jié)果見圖1。

圖1 提取方法對(duì)提取蔬菜中兩種抗生素回收率的影響Fig.1 The influence of extraction methods on extraction efficiency of two antibiotics in vegetables

由圖1可知,提取方式對(duì)白菜中兩種抗生素的提取回收率有較大的影響。通過方案①和其他幾種方案比較,發(fā)現(xiàn)超聲處理對(duì)TC的影響較大,未超聲時(shí)TC回收率低于20%,而不同提取方法對(duì)白菜中OTC提取回收率影響不太大,回收率均達(dá)60%以上。綜合考慮,選取方案③作為最佳提取方式。

2.2 提取溶液pH值的優(yōu)化

OTC和TC性質(zhì)相似,可以在酸性介質(zhì)中形成具有高溶解度的鹽,有利于提取[11]。綜上,選取pH值為2.0,3.0,4.0,5.0的提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),提取后回收率結(jié)果見圖2。

圖2 提取液pH值對(duì)提取蔬菜中兩種抗生素回收率的影響Fig.2 The influence of pH value of extraction solvents on extraction efficiency of two antibiotics in vegetables

由圖2可知,在pH值為2.0～5.0之間時(shí),白菜中OTC的提取回收率隨著pH的增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢,在提取液pH=3.0時(shí),OTC的提取回收率最高；TC的提取回收率在所選取的pH值范圍內(nèi)無明顯趨勢,在pH=5.0時(shí),TC的提取回收率最高。根據(jù)提取液pH值不同時(shí),抗生素的提取回收率的大小綜合考慮,選取pH=3.0的水溶液進(jìn)行提取。

2.3 提取液用量的選擇

按考察出的最優(yōu)提取方式和最佳pH值對(duì)提取液體積進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)已有研究表明,固體與液體(植物與提取液)的比例是化學(xué)化合物吸附/解吸過程的關(guān)鍵參數(shù)[12]。 考慮到兩種抗生素的溶解度和MIP在水中的溶脹性能,選取了總體積為10,15,20,30 mL的提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖3可知,當(dāng)提取液體積為15 mL時(shí),兩種抗生素的回收率效果整體最優(yōu),因此選擇提取液的體積為15 mL,即植物質(zhì)量與提取液體積比(固液比)為2∶3 g/mL。

圖3 固液比對(duì)提取蔬菜中兩種抗生素回收率的影響Fig.3 The influence of solid-liquid ratio on extraction efficiency of two antibiotics in vegetables

2.4 植物樣品中抗生素的加標(biāo)回收率

用上述優(yōu)化的預(yù)處理方法進(jìn)行分析,當(dāng)添加濃度為100～1 500 μg/kg時(shí),計(jì)算得白菜樣品中OTC和TC不同加標(biāo)濃度下的平均加標(biāo)回收率分別為(71.1±3.83)%和(53.49±3.77)%(n=9) (表1)。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度能滿足實(shí)際蔬菜樣品分析要求。

表1 白菜中兩種抗生素的實(shí)際回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviation of two antibiotics in cabbage

2.5 Oasis HLB柱萃取方法的加標(biāo)回收率

為了驗(yàn)證所建立的方法的準(zhǔn)確性和可靠性,采用較為常用的前處理方法-Oasis HLB固相萃取法對(duì)白菜中兩種抗生素進(jìn)行加標(biāo)回收處理,在相同的色譜條件下進(jìn)行測定,兩種抗生素的實(shí)際加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。

表2 Oasis HLB柱萃取法提取白菜中兩種 抗生素的實(shí)際加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviation of two antibiotics in cabbage by Oasis HLB

由表2可知,在不同加標(biāo)濃度下,OTC和TC的加標(biāo)回收率分別為53.47%～88.99%和68.25%～88.66%；RSD分別為0.51%～9.04%和0.82%～8.41%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道值相近[13]。

2.6 實(shí)際樣品的測定

利用本文所建立的分析方法,對(duì)新疆烏魯木齊市郊某蔬菜基地中現(xiàn)場采集的7種蔬菜同時(shí)進(jìn)行了分析,結(jié)果見表3。

表3 實(shí)際樣品中OTC和TC的含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of OTC and TC in field samples

注：ND為未檢出。

由表3可知,7種實(shí)際樣品中兩種抗生素的檢出濃度差異顯著。有兩種樣品中未檢出OTC和TC,其中西紅柿和長豇豆中兩種抗生素均未檢出,白菜和西蘭花中TC檢出含量較高,蘿卜中OTC的檢出含量最高。表明同一塊地域,不同植物中抗生素含量的多少與植物種類有關(guān)[8]。

3 結(jié)論

結(jié)合分子印跡技術(shù),建立了一種蔬菜中四環(huán)素和土霉素含量測定的快速前處理方法,并對(duì)其提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)蔬菜樣品的分析結(jié)果表明,該方法能夠滿足實(shí)際樣品的分析要求。與傳統(tǒng)利用有機(jī)溶劑提取的固相萃取方法比較,本方法具有價(jià)格低廉、環(huán)境友好、可用于建立現(xiàn)場自動(dòng)監(jiān)測技術(shù)等特點(diǎn)。