RNA干擾CST1基因表達對結直腸癌細胞增殖侵襲及STAT3信號通路的影響

結直腸癌是常見的消化道腫瘤，近年來其發病率呈現上升趨勢[1]。大量研究表明，結直腸癌的發生發展是一個涉及基因表達過度、抑癌基因失活、癌基因激活的多步驟、多基因參與的復雜過程[2]。目前基因的靶向治療已成為預防結直腸癌發生及降低病死率的一個重要手段。CST1基因定位于20p11.21染色體，編碼一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin SN，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族。近年來大量研究表明，過度表達的CST1在惡性腫瘤細胞的增殖、轉移及浸潤等方面發揮關鍵作用。如CST1表達上調的膀胱移行細胞癌患者的復發率較高[3]，胃癌中CST1基因異常高表達，RNA干擾其表達后可降低細胞增殖[4]。CST1基因在結直腸癌中的研究較少，有研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin C與Cystatin SN一樣，也屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族，在結腸腺癌中的表達高于正常對照組[5]，但CST1表達對結直腸癌細胞生物學特性及機制尚未明確。信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)是細胞內重要的信號途徑，與包括結直腸癌在內的多種腫瘤的發生、發展密切相關[6]。本研究檢測了不同結直腸癌細胞中的CST1表達，采用RNA干擾抑制其表達，觀察CST1表達被抑制后的細胞活力及侵襲能力，并進一步研究其對STAT3信號通路的影響，以期為結直腸癌的診療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑和儀器

正常結腸NCM460細胞及人結直腸癌SW480、HCT116、Caco2和HT29細胞均購自美國模式培養物集存庫(ATCC)；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、MTT溶液、DMSO均購自美國Sigma公司；Transwell侵襲小室購自美國Corning公司； STAT3、磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3(p-STAT3)、增殖細胞核抗原(PCNA)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自美國CST公司；酶標儀購自美國Biotek公司。

1.2 細胞培養

NCM460、SW480、HCT116、Caco2和HT29細胞在37 ℃、5%體積分數CO2培養箱中用DMEM培養基培養，細胞生長達80%融合密度時，使用胰酶消化后傳代。實驗取生長至對數期的細胞。

1.3 轉染

根據siRNA的設計原則，設計針對CST1的特異性siRNA(si-CST1組)，同時設計陰性對照siRNA(NC組)，且序列經BLAST同源比較分析后顯示與其他人類基因序列無同源性，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。轉染前24 h，以1×105個/孔接種生長至對數期的HCT116細胞于6孔板，細胞80%～90%匯合時，將已制備好的siRNA-Lip2000混合物加入6孔板，空白對照組僅加入脂質體，轉染參照LipofectamineTM2000說明，培養箱內孵育轉染好的細胞5～6 h，更換培養基(含血清及抗生素)后繼續培養，48 h后收集細胞，用于后續實驗研究。

1.4 細胞活力檢測

HCT116細胞以5×103個/孔接種于96孔板，常規培養24 h后，將CST1的特異性siRNA及陰性對照siRNA轉染細胞，并設置空白對照組，收集轉染48 h的3組細胞，加入MTT溶液(5 mg/mL)，每孔20 μL，于37 ℃條件下孵育4 h，吸棄孔內溶液，加入150 μL的DMSO溶液于每孔中，震搖混勻15 min，490 nm波長，酶標儀測定各個孔的吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.5 細胞侵襲能力檢測

實驗前在Transwell小室中間的聚碳酸酯濾膜上鋪上已預先稀釋好的Matrigel膠。將生長至對數期的HCT116細胞參照1.3分組制備成不含血清的單細胞懸液100 μL(約1×105個細胞)，接種于Transwell小室的上室，Transwell小室下室的每孔中加入含血清的培養基500 μL，于37 ℃、5%體積分數CO2培養箱中孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%的結晶紫染色10 min，PBS洗滌后將小室轉移至24孔板，隨機選擇6～8個視野，倒置顯微鏡觀察穿膜細胞數，取均值。實驗重復3次。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白上樣，依次經10%SDS-PAGE、轉膜、封閉后，加入均按照1∶500稀釋的STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2、MMP-9及內參GAPDH抗體，洗膜，加HRP標記的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，顯影，定影，應用gel pro 4.0軟件分析各蛋白條帶灰度值，目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值為各蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 5種細胞中CST1蛋白的表達

正常結腸NCM460細胞和人結直腸癌SW480、HCT116、Caco2和HT29細胞中CST1蛋白的表達分別為0.068±0.009、0.254±0.028、0.478±0.050、0.268±0.030、0.339±0.035。4種人結直腸癌細胞中CST1蛋白的表達均顯著高于正常結腸NCM460細胞，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 5種細胞中CST1蛋白表達的比較

2.2 CST1 siRNA轉染的效果

空白對照組、NC組和si-CST1組HCT116細胞中CST1蛋白的表達分別為0.526±0.054、0.515±0.051、0.096±0.012。si-CST1組HCT116細胞的CST1蛋白表達顯著低于空白對照組(P<0.05)，而NC組HCT116細胞的CST1蛋白表達與空白對照組的差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 3組HCT116細胞中CST1蛋白表達的比較

2.3 CST1 siRNA對HCT116細胞活力和侵襲能力的影響

各組細胞活力和侵襲能力檢測結果顯示，與NC組比較，si-CST1組細胞活力顯著降低，細胞侵襲能力顯著降低，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。見表1、圖3。

表1 3組HCT116細胞的活力和侵襲能力比較()

注：與NC組比較，aP<0.05

圖3 3組HCT116細胞的侵襲能力比較 A 空白對照組 B NC組 C si-CST1組

2.4 CST1 siRNA對3組HCT116細胞中STAT3信號通路的影響

Western blotting檢測STAT3、p-STAT3及STAT3信號通路下游與增殖、侵襲相關的PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白的表達，結果顯示，與NC組相比，si-CST1組HCT116細胞中p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白的表達均顯著降低(P均<0.05)。3組HCT116細胞中STAT3蛋白表達的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖4。

表2 3組HCT116細胞中STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達的比較

注：與NC組比較，aP<0.05

圖43組HCT116細胞中STAT3、p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達的比較

3 討論

惡性腫瘤的發生、發展與基因表達異常、突變等有密切關系，目前已明確了腫瘤發生的部分機制，但惡性腫瘤的侵襲轉移及向周圍浸潤仍是腫瘤治療的一個難題。有研究表明，CST1基因異常表達與腫瘤發生、發展密切相關。CST1表達對胰腺癌增殖起促進作用，可作為胰腺癌早期檢測的潛在生物學標志物[7]；CST1的高表達與乳腺癌患者生存期呈負相關，可促進乳腺癌細胞的增殖、克隆形成能力及轉移[8]。CST1對結直腸癌的影響尚未明確，因此本研究首先檢測了不同結直腸癌細胞中的CST1表達，發現結直腸癌細胞中CST1表達均明顯高于正常結腸細胞，結直腸癌HCT116細胞中CST1表達最高，故選擇其作為研究對象。RNA干擾(RNAi)技術是一種能在轉錄后阻斷特異性基因表達的新技術，具有高效性和特異性，與其他基因表達阻斷技術相比更具優勢，目前已廣泛應用于腫瘤治療、基因功能研究等方面[9-10]。本研究將設計合成的CST1的特異性siRNA轉染HCT116細胞，發現CST1表達受到抑制后結腸癌細胞的活力及侵襲能力均明顯降低，提示CST1表達受抑可抑制結直腸癌細胞的生長。

STAT3是STAT家族成員，其與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、血管形成、分化等密切相關。研究表明，在結直腸癌、肺癌等多種人類腫瘤中均存在STAT3信號的異?；罨?，其活化可加速腫瘤進展，因此被稱為癌基因[11-12]。另有研究顯示，抑制結直腸癌細胞的STAT3信號可抑制腫瘤細胞的生長[13]。STAT3并不直接引起腫瘤發生，而是通過調節某些與腫瘤生長相關的因子的表達從而影響腫瘤的發生、發展。PCNA是一種僅出現在增殖狀態細胞核內的酸性蛋白質，是合成DNA不可或缺的因子，在包括結直腸癌在內的多種腫瘤中表達升高，其表達水平可反映細胞的增殖狀態[14]。高侵襲和遷移能力是惡性腫瘤細胞的主要特征，而細胞外基質是抑制腫瘤細胞轉移的主要屏障。MMP-2和MMP-9是MMP家族的主要蛋白水解酶，參與細胞外基質的降解，其異常表達可破壞細胞外基質平衡，促進腫瘤的侵襲和轉移[15]。研究表明，結直腸癌、肺癌等多種腫瘤中均可檢測到MMP-2和MMP-9表達水平升高，而抑制MMP-2和MMP-9表達可減弱結直腸癌細胞的侵襲遷移能力[16-17]。本研究結果顯示，CST1基因表達受抑可降低p-STAT3、PCNA、MMP-2和MMP-9的表達，提示CST1基因對結直腸癌細胞生長的影響與下調STAT3信號通路有關。

綜上所述，RNA干擾 CST1基因表達可抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲，其機制可能與下調STAT3信號通路有關。本研究結果提示CST1可能是結直腸癌診療的一個有效靶點，但這需要更多的研究證實。