血清miR-200a、miR-190聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌診斷及預(yù)后評估中的應(yīng)用價值

結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其起病隱匿，預(yù)后不良，發(fā)病率較高[1]。早期結(jié)直腸癌患者經(jīng)手術(shù)治療后的5年生存率可達(dá)90%以上，而發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者和晚期患者的5年生存率低于15%[2]。目前臨床上篩查結(jié)直腸癌的血清標(biāo)志物包括癌胚抗原、糖類抗原19-9(CA19-9)等，但其敏感度和特異度均較低，且對術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測中效果并不理想[3]。因此，尋找更有效的血清標(biāo)志物對于改善患者的預(yù)后具有重要意義。微RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，在動植物及病毒中均廣泛存在。近年來，隨著分子醫(yī)學(xué)及相關(guān)檢測手段的飛速發(fā)展，miRNA在各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中的作用已得到學(xué)者們的廣泛認(rèn)可[4]。研究表明，miR-200a、miR-190在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著抑癌基因的作用，其在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，且與多種惡性腫瘤關(guān)系密切[5-6]。本研究通過檢測miR-200a、miR-190在健康人群及結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)水平，并比較其在術(shù)后復(fù)發(fā)患者和未復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)差異，探討其在結(jié)直腸癌診斷及預(yù)后評估中的價值，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 基本資料

選擇2016年1月至2018年1月期間在昌江縣人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的63例結(jié)直腸癌患者作為結(jié)直腸癌組，患者均經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)確診。患者均隨訪1年，根據(jù)復(fù)發(fā)情況分為術(shù)后復(fù)發(fā)組(16例)和術(shù)后未復(fù)發(fā)組(47例)。排除轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，排除合并其他部位腫瘤及術(shù)前經(jīng)放射治療、化學(xué)治療等可能影響本研究結(jié)果的患者。另選取35位同期健康體檢者作為對照組。結(jié)直腸癌組中，男37例，女26例，平均年齡(63.47±8.36)歲；對照組中，男20例，女15例，平均年齡(63.15±7.92)歲。將結(jié)直腸癌組分為兩個亞組：術(shù)后復(fù)發(fā)組中，男10例，女6例，平均年齡(63.57±7.84)歲；術(shù)后未復(fù)發(fā)組中，男28例，女19例，平均年齡(62.89±8.21)歲。結(jié)直腸癌組與對照組、術(shù)后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的年齡、性別等基本資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)患者知情同意，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會核準(zhǔn)后進行。

1.2 方法

結(jié)直腸癌組患者于術(shù)前及術(shù)后3個月清晨采集外周靜脈血標(biāo)本5 mL，對照組于體檢當(dāng)日采集外周靜脈血標(biāo)本5 mL。所有血清標(biāo)本均采用醫(yī)用離心機3 000 r/min離心15 min，取上清液置于-20℃的冰箱保存待測。miR-200a、miR-190相對表達(dá)量應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)進行分析，Trizol法抽提與純化總RNA，確保純度符合要求，以總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以cDNA為模板行熒光定量PCR，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，然后以U6為外參基因，采用2-△△Ct表示相對表達(dá)量。熒光定量PCR試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司提供，所有檢測操作均嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書進行。

1.3 觀察指標(biāo)

比較結(jié)直腸癌組與對照組的血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平，術(shù)后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平，以及其與臨床病理之間的關(guān)系。應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC)評價血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌及預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平比較

與對照組相比，結(jié)直腸癌組的血清miR-200a、miR-190的相對表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組的血清miR-200a、miR-190相對表達(dá)量比較()

2.2 血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者的miR-200a相對表達(dá)量低于Ⅰ～Ⅱ期患者，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-200a和miR-190的相對表達(dá)量均低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 血清miR-200a、miR-190相對表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的效能分析

因變量為二分類變量，對照組標(biāo)記為0，結(jié)直腸癌組標(biāo)記為1，自變量為miR-200a、miR-190的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，miR-200a、miR-190聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積(AUC)明顯大于單指標(biāo)檢測(Z=3.567，P=0.019；Z=2.396，P=0.041)，聯(lián)合檢測的敏感度、特異度均優(yōu)于單指標(biāo)檢測(P<0.05)。見圖1和表3。

圖1 血清miR-200a、miR-190水平診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

表3 血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的效能

注：“—”表示無數(shù)據(jù)

2.4 術(shù)后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組術(shù)后3個月的血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平比較

結(jié)直腸癌患者術(shù)后隨訪1年，復(fù)發(fā)16例，未復(fù)發(fā)47例。復(fù)發(fā)組術(shù)后3個月的血清miR-200a、miR-190相對表達(dá)量均低于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組術(shù)后3個月的血清miR-200a、miR-190相對表達(dá)量比較()

2.5 術(shù)后3個月的血清miR-200a、miR-190水平預(yù)測結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的效能分析

因變量為二分類變量，術(shù)后未復(fù)發(fā)組標(biāo)記為0，術(shù)后復(fù)發(fā)組標(biāo)記為1，自變量為miR-200a、miR-190的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，miR-200a、miR-190聯(lián)合檢測的AUC大于單指標(biāo)檢測(Z=3.146，P=0.028；Z=2.451，P=0.043)，聯(lián)合檢測的敏感度、特異度均優(yōu)于單指標(biāo)檢測(P<0.05)。見圖2和表5。

圖2血清miR-200a、miR-190水平預(yù)測結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

表5 血清miR-200a、miR-190水平預(yù)測結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的價值

注：“—”表示無數(shù)據(jù)

3 討論

隨著人們生活水平的改善以及飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌已成為臨床上常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率不斷升高且呈年輕化趨勢，每年有近50%發(fā)病患者死亡[7]。研究表明，早期結(jié)直腸癌患者預(yù)后較好，而晚期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差[8]。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，尋找有效的早期診斷指標(biāo)，對指導(dǎo)臨床早期診治及預(yù)后評估具有重要意義[9]。近年來，miRNA已成為腫瘤研究的熱點，其通過調(diào)控信使RNA(mRNA)降解或沉默蛋白翻譯，參與細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程[10]。miRNA的失調(diào)涉及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的多個細(xì)胞進程，包括分化、增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。目前已發(fā)現(xiàn)上千種miRNA，不同部位、類型的腫瘤具有特異的miRNA表達(dá)譜[11]。

miR-200a、miR-190可在血液、尿液及腦脊液等體液中檢出，穩(wěn)定性較好，可作為血清腫瘤標(biāo)志物。有報道指出，miR-190可通過降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)，抑制腫瘤新生血管形成，繼而抑制腫瘤生長[12]。miR-190可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中的DPC4基因表達(dá)，并負(fù)向調(diào)控，起著抑癌基因的作用[13]。miR-200a是miR-200家族成員之一，其可通過調(diào)控EMT過程，對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平均低于對照組，且與TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示miR-200a、miR-190可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。O′Brien等[15]和Lin等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a、miR-190與結(jié)直腸癌的發(fā)生關(guān)系密切，其在結(jié)直腸癌的早期診斷中具有較高的參考價值。本研究結(jié)果顯示，miR-200a、miR-190表達(dá)水平診斷結(jié)直腸癌的AUC分別為0.790、0.882，兩者聯(lián)合診斷的AUC為0.903，敏感度為86.36%，特異度為81.25%，聯(lián)合診斷的敏感度和特異度較高。

目前有關(guān)miR-200a、miR-190的表達(dá)水平在預(yù)測結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中價值的研究尚不多見。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者較長的總生存期有關(guān)[17]。miR-190是ZEB1的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，其表達(dá)降低可導(dǎo)致胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)水平升高，促進腫瘤的進展，與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3個月復(fù)發(fā)組的血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平低于未復(fù)發(fā)組，ROC曲線分析顯示miR-200a、miR-190表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.875、0.895，兩者聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.932，敏感度為91.58%，特異度為86.33%，提示聯(lián)合預(yù)測的敏感度和特異度較高。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者的血清miR-200a、miR-190表達(dá)水平降低，可作為結(jié)直腸癌早期診斷及預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的標(biāo)志物，兩者聯(lián)合檢測可提高診斷及預(yù)測的敏感度和特異度。