GFPT2在胃癌中的表達及作用的研究

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，每年約有100萬患者被確診[1]。飲食習慣、肥胖、吸煙、慢性感染尤其是幽門螺桿菌(Hp)感染都會導致胃癌發生[2-3]。在中國，由于胃癌患者確診時多數是晚期，故療效不佳，5年生存率較低[4]。因此，尋找能預測早期胃癌和轉移相關的標志物以及有效治療胃癌的新靶點具有重要意義。谷氨酰胺果糖-6-磷酸轉氨酶2(GFPT2)基因位于染色體 5g34～5g35.2 區域，在冰島糖尿病家系研究中發現該區域與糖尿病有關[5]，支持GFPT2是2型糖尿病的候選基因。與非侵襲性上皮細胞株相比，具有高度侵襲性的乳腺癌細胞株中GFPT2表達的升高[6]。GFPT2表達的升高還與2型糖尿病有關[7]。而目前尚未見GFPT2與胃癌關系的研究報道，本研究主要探討GFPT2在胃癌組織中的表達情況及作用。

1 材料和方法

1.1 組織標本和細胞系

選擇2014年1月至2015年6月在樂山市人民醫院接受胃切除手術、切除標本經病理診斷為胃癌的82例患者，其中男性49例，女性33例，年齡23～72歲，平均年齡(56.2±4.56)歲，收集82例患者的配對胃癌及癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣5 cm)石蠟標本。另收集2017年6月至2018年7月在樂山市人民醫院胃腸外科經手術切除的33例患者配對的新鮮胃癌組織及癌旁正常組織。正常胃黏膜上皮細胞株GES和胃癌細胞株MGC803、MKN45、BGC823、AGS由南方醫科大學病理學系任小莉博士提供。細胞培養用加入10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，培養皿置于37 ℃、5%CO2培養箱中。

1.2 Real-time PCR檢測GFPT2 mRNA的表達水平

收集細胞，按Trizol 和反轉錄試劑說明書分別提取RNA 及反轉錄合成cDNA。引物序列見表1。PCR反應體系10 uL，反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。目的基因以2-ΔΔCt表示，目的基因引物由Sangong Biotech公司合成。

表1 引物序列

1.3 Western blotting檢測GFPT2蛋白的表達水平

總蛋白經SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜上。將膜置于GFPT2一抗過夜(1∶500)。漂洗一抗后，室溫孵育兔二抗(1∶10 000)1 h。PBST洗膜3次，每次10 min，加入化學發光物和顯色試劑，于暗室中曝光、顯影、定影。GAPDH為內參。

1.4 免疫組織化學檢測GFPT2蛋白的表達水平

將胃癌及癌旁正常組織石蠟標本進行3 μm連續切片，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素SP法染色。枸櫞酸鹽高溫高壓5 min進行抗原修復，DAB顯色。以細胞質內出現淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為GFPT2陽性細胞，陽性細胞占腫瘤細胞的比例為陽性率。由2名以上病理醫師(主治醫師)獨立評分，評分結果取平均值。根據物鏡下腫瘤細胞陽性染色范圍分為4個等級：陽性率<5%為0分，5%～30%為1分，31%～70%為2分，>70%為3分；依據對每張切片陽性細胞的染色強度進行評定，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩個計分的乘積為染色的評判結果：0分為陰性(-)，統計時記為0分；1～4分為弱陽性(+)，統計時記為1分；5～8分為陽性(++)，統計時記為2分；9～12分為強陽性(+++)，統計時記為3分。每張切片隨機選取5個高倍視野進行統計分析并取均值。

1.5 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗。所有檢驗均為雙側檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。胃癌組織石蠟切片中GFPT2蛋白表達水平與臨床病理參數的相關性采用Wilcoxon Signed Ranks檢驗分析和Spearman相關分析。

2 結果

2.1 配對新鮮組織標本中GFPT2 mRNA的表達水平

將33例配對的新鮮胃癌組織及癌旁正常組織進行Real-time PCR檢測。設定癌旁正常組織中GFPT2 mRNA表達水平為1，采用 2-ΔΔCT公式計算胃癌組織中GFPT2 mRNA的相對表達量。結果顯示33例患者的新鮮配對組織中，有27例胃癌組織中GFPT2 mRNA水平高于癌旁正常組織(t=2.891，P=0.007，圖1A)，并且伴有肝轉移的胃癌組織中的GFPT2 mRNA水平高于不伴有肝轉移的胃癌組織(P=0.0015，圖1B)。

圖1新鮮配對組織標本中GFPT2 mRNA表達水平A33對新鮮胃癌組織及癌旁正常組織中GFPT2 mRNA的表達水平B伴有肝轉移和不伴有肝轉移的胃癌組織中GFPT2 mRNA表達水平比較

2.2 配對胃癌組織及癌旁正常組織石蠟切片中GFPT2蛋白表達水平

GFPT2蛋白表達定位于細胞質，胃癌組織中GFPT2表達陽性率為98.45%，平均表達強度為2.06±0.852 5，癌旁正常黏膜組織中GFPT2表達陽性率為20.60%，平均表達強度為0.79±0.563 3，根據染色范圍及染色強度的乘積結果進行統計分析，結果顯示胃癌組織中GFPT2蛋白表達要明顯高于癌旁正常組織，兩者差異有統計學意義(Z=-7.18，P<0.001)。見圖2。

圖2癌旁正常組織和胃癌組織石蠟切片中GFPT2蛋白的表達A癌旁正常組織 ×200B胃癌組織 ×200

2.3 胃癌組織石蠟切片中GFPT2蛋白表達與臨床病理參數的相關性分析

結果顯示，胃癌組織中GFPT2蛋白表達的高低與腫瘤分化程度、是否有遠處轉移及淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤深度無關(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中GFPT2蛋白表達與臨床病理參數的相關性/例

2.4 細胞株中GFPT2 mRNA和蛋白的表達水平

采用Real-time PCR法檢測出5種細胞株中GFPT2 mRNA表達水平的CT值，將正常胃黏膜上皮細胞株GES中GFPT2 mRNA表達水平設定為1，采用2-ΔΔCT公式計算各細胞株中GFPT2 mRNA的相對表達量。結果顯示，與正常胃黏膜上皮細胞株GES相比，胃癌細胞株MGC803、MKN45、BGC823和AGS中GFPT2 mRNA表達水平更高(P<0.05)。此外，高轉移潛能胃癌細胞株MKN45和BGC823 中 GFPT2 mRNA的相對表達量分別為9.809 0±1.505 2、5.825 6±1.469 0，低轉移潛能胃癌細胞株AGS及MGC803中GFPT2 mRNA的相對表達量分別為3.423 3±0.846 5、1.842 6±0.282 9。上述結果提示胃癌細胞株中GFPT2 mRNA的表達水平明顯高于正常胃黏膜上皮細胞株GES，且高轉移潛能胃癌細胞株中GFPT2 mRNA的表達水平較低轉移潛能胃癌細胞株高(P<0.05)。進一步提取上述5種細胞株的總蛋白進行Western blotting法檢測，結果顯示正常胃黏膜上皮細胞株GES中GFPT2蛋白表達水平低于胃癌細胞株MGC803、BGC823及MKN45(P<0.05)，但與AGS的差異無統計學意義；高轉移潛能細胞株MKN45和BGC823中GFPT2蛋白表達水平高于低轉移潛能細胞株AGS及MGC803(P<0.05)。見圖3。

圖3 5種細胞株中GFPT2 mRNA和蛋白的表達水平比較 A GFPT2 mRNA表達水平 B GFPT2蛋白表達水平

3 討論

隨著醫療技術的發展，胃癌發病率和病死率已明顯下降，但其目前仍是世界第3位惡性腫瘤[8-10]。研究胃癌的發病機制，為臨床提供新的治療靶點具有重要的意義。

GFPT屬于高度保守的基因，是氨基己糖途徑(HBP)的第一個限速酶，該酶是由非連鎖但高度同源的GFPT l和GFPT 2基因編碼，使L-6-磷酸-谷酰胺果糖轉化形成6-磷酸-氨基葡萄糖。而6-磷酸-氨基葡萄糖是蛋白和脂類糖基化中己醣胺的重要前體[11]。GFPT酶包括兩個重要的結構域，谷氨酰胺酶結構域和合酶結構域，前者可使谷氨酰胺水解為谷氨酸和氨，后者可使6-磷酸果糖氨基化和異構化形成6-磷酸-氨基葡萄糖。GFPT1和GFPT2是相互獨立的位于不同染色體上的兩個基因，在不同組織中的表達也有所不同。胰腺、胎盤、睪丸中GFPT1的表達水平高于GFPT2，而在神經系統特別是脊髓中GFPT2的表達水平明顯高于GFPT1[12]。以往文獻已證明氨基葡萄糖可引起血糖毒性和胰島素抵抗，GFPT表達的改變可引起糖尿病發生[13]。目前GFPT1被研究得較多，主要研究O-GlcNAc 糖基化修飾、胰島素抵抗及GFPT1在腫瘤中的表達上調等[14-15]。此外，GFPT1的突變還與先天性肌無力綜合征相關[16]。目前尚未見GFPT2在胃癌中的作用及機制的相關研究報道。

本研究中首先檢測了GFPT2在33例配對新鮮胃癌組織及癌旁正常組織中GFPT2 mRNA的表達水平，結果顯示胃癌組織中GFPT2 mRNA表達水平明顯高于正常組織。本研究還檢測了82例配對胃癌及癌旁正常組織石蠟標本中GFPT2蛋白表達情況。結果顯示胃癌組織中GFPT2蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織，且GFPT2蛋白表達與腫瘤分化程度、遠處轉移及淋巴結轉移密切相關，而與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤深度無關。這些結果說明GFPT2在胃癌組織中呈高表達且與胃癌轉移密切相關。此外，本研究還檢測了正常胃黏膜上皮細胞株GES 和 4 種胃癌細胞株(AGS、MGC803、MKN45和BGC823)中GFPT2 mRNA和蛋白的表達水平，結果顯示GFPT2在胃正常黏膜上皮細胞GES中的表達最低，在低分化的轉移潛能較高的胃癌細胞株MKN45和BGC823中的表達較高，這進一步說明了GFPT2在胃癌的轉移中可能起著促進作用。以往研究顯示，GFPT2與糖尿病的發生密切相關，是2型糖尿病的候選基因[5]。但其在腫瘤方面的文獻較少，僅有幾篇。在后續的研究中，將著重研究USP18促進胃癌侵襲和增殖的分子機制及其在臨床治療中的應用價值。

綜上所述，本研究結果顯示，GFPT2在胃癌組織中高表達，與胃癌的發生及轉移密切相關，為臨床治療胃癌提供了一個潛在的新靶點，也為進一步研究奠定了良好的基礎。