Btk/NF-κB信號通路在視神經脊髓炎譜系疾病中變化及意義

王 煒，王素歡，李世平，侯慧清，楊 靜，吳冰潔，董 梅

視神經脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是體液免疫為主的中樞神經系統(central nervous system，CNS)自身免疫性疾病，反復發作，主要侵犯視神經和脊髓，是青壯年致殘的重要原因之一。

水通道蛋白4(Aquaporin 4，AQP4)抗體(AQP4-Ab)是由B細胞產生的NMOSD特異性抗體，B細胞是疾病發生的重要參與者。B細胞的活化、增殖和分化主要受B細胞抗原受體(B cell antigen receptor，BCR)信號通路調控。當BCR受到抗原或B細胞活化因子刺激后，將信號傳至胞內，胞質中多種蛋白酪氨酸激酶可激活下游效應器，其中很重要的一種激酶就是Bruton酪氨酸激酶(bruton’s tyrosine kinase，BTK)，它是B細胞發育成熟并行使免疫功能的關鍵因素，在炎癥反應中發揮重要作用[1]。BTK首先激活與之緊密聯系的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，產生“第二信使”，促進B細胞正常分化發育或參與炎癥反應， PI3K通過激活核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor kappa B Kinase，IKK),介導NF-κB核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)入核，NF-κB通過調控靶基因轉錄，影響B細胞增殖、分化和抗體產生，并促進炎癥因子產生[2]。

B細胞可以分化為調節性B細胞(Breg)、漿細胞(產生抗體)及效應B細胞等不同細胞亞群，分泌多種抗炎和促炎因子，維持免疫平衡，而BTK/NF-κB 通路中相關各激酶異常可能是介導B細胞異常分化、導致免疫失衡的關鍵因素。 故本文擬通過測定NMOSD急性期患者與健康對照組中的BTK/NF-κB信號通路中BTK、NF-κB、PI3K、IKK mRNA表達水平，探討其在NMOSD急性期的變化及對疾病可能的影響作用。

NMOSD患者長節段性橫貫性脊髓炎(longitudinally extensive transverse myelitis，LETM)更常見，病灶多大于3個脊髓節段。AQP4-Ab血清陽性狀態對孤立性LETM或視神經炎(optic neuritis，ON)患者具有重要的預后和治療意義[3]。故本文通過檢測NMOSD急性期患者AQP4-Ab血清陽性與否及其滴度水平，及脊髓MRI中受累節段數，探討AQP4-Ab對脊髓受累的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取2018年1月-2019年1月就診于河北醫科大學第二醫院東院區神經內科的33例急性期視神經脊髓炎譜系疾病患者為實驗組[急性期：患者出現新的神經系統癥狀體征，持續時間大于24 h不緩解，擴展殘疾狀態量表(Expanded Disability Status Scale，EDSS)評分增加≥1分]，同期選取性別、年齡相似的33位健康志愿者作為對照組。所有患者均經由我科主治及以上資質的醫師診斷，符合最新NMOSD指南制定的診斷標準。本實驗征得研究對象或家屬同意后簽署知情同意書后進行，所有患者在給予任何免疫治療前抽取外周血。

1.2 標本采集 所有受試對象征得知情同意后，抽取空腹急性期激素治療前靜脈血2 ml，置于EDTA管中，1500 rpm，離心5 min，分離出血細胞。將血細胞用PBS以1∶1的比例稀釋，將稀釋的血細胞緩緩加入5 ml的Ficoll淋巴細胞分離液的上方，置于離心機中2000 rpm密度梯度離心20 min，離心管第二層云霧狀細胞層為單個核細胞層。吸取第二層云霧狀細胞于新的離心管中，加入細胞洗滌液12 ml，搖勻后以1500 rpm離心10 min，舍棄上清液去沉淀得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)懸液。將其分為兩份，分裝于EP管內，每管細胞數大致相當，約1×106個。而后將PBMCs懸液分別存于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集 記錄所有研究對象的基本信息，包括：姓名、性別、年齡、病程、EDSS評分，復發次數，血AQP4-Ab結果、脊髓MRI平掃及強化結果，依據強化結果確定此次發病的脊髓受累節段數。

1.3.2 采用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法進行檢測人外周血PBMCs中BTK、NF-κB、PI3K、IKK的mRNA含量，實驗操作按產品說明書進行。

1.3.2.1 Real Time PCR檢測目的基因引物在北京Invitrogen公司合成。

1.3.2.2 提取樣本總RNA采用TRNzol總RNA提取試劑提取樣本RNA，使用NanoDrop?ND-2000測定RNA濃度和純度。

1.3.2.3 逆轉錄合成cDNA采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行，具體操作如下：(1)去除基因組DNA反應，于冰上配制反應混合液，5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μl，gDNA Eraser 1.0 μl，Total RNA 1 μg，RNase Free H2O Up to 10 μl，42 ℃孵育2 min；(2)反轉錄反應：上述反應液加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl，RT Primer Mix 1.0 μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，RNase Free H2O 4.0 μl，共20 μl，37 ℃孵育15 min，之后放入85 ℃ 5 s，cDNA保存至-20 ℃冰箱備用。

1.3.2.4 Real Time PCR樣本檢測 將所有cDNA樣品分別配置RT-PCR反應體系。體系配置如下：2 × Master Mix 10 μl，10 μmol的PCR特異引物F 0.5 μl，10 μmol 的PCR特異引物R 0.5 μl，加水至總體積為18 μl 5000 rpm短暫離心；將18 μl混合液、2 μl cDNA依次加入96-PCR板對應的每個孔中，粘上封口膜，混勻，置于冰上；將96-PCR板置于Realtime PCR儀上，以95 ℃，30 s；40個PCR循環[95 ℃，5 s；60 ℃，40 s(收集熒光)]。建立PCR產物的熔解曲線，從60 ℃緩慢加熱到99 ℃來進行PCR反應。將目的基因和內參分別進行Realtime PCR反應，每個樣本進行3個復孔檢測。儀器自動匯總熒光值后進行分析。

1.3.3 血液AQP4-Ab水平測定 患者抽取的檸檬酸鈉管靜脈血送至北京協和醫院行免疫組化染色法測定AQP4-Ab水平。

2 結 果

2.1 研究對象的一般資料 NMOSD患者共33例，女性30例，男性3例，發病年齡19～67(42±14.75)歲；患者均符合NMOSD診斷標準，EDSS評分2.0～9.0分，中位數為3.5分，四分位數間距為2.8分，復發患者占69.70%。行脊髓MRI平掃及強化檢查24例，脊髓MRI受累階段數0～17(5.67±4.36)，累及頸段、上胸段23例，累及下胸段、腰段4例，受累節段≥3個椎體節段17例；行AQP4-Ab水平檢測25例，女性23例，男性2例，AQP4-Ab陽性率80%；對照組33例，各組間在性別、年齡方面無統計學差異。

2.2 NMOSD急性期患者與健康對照組BTK、PI3K、IKK、NF-κB mRNA水平相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖1～圖4)。

2.3 NMOSD急性期患者AQP4-Ab陽性者較陰性者脊髓受累節段數多，差異有統計學意義(P<0.05)；AQP4-Ab滴度與脊髓受累節段數無線性相關關系(P>0.05)(見圖5、圖6)。

圖1 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對照組，兩組血液PBMCs中BTK mRNA對數水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖2 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對照組，兩組血液PBMCs中PI3K mRNA對數水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖3 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對照組，兩組血液PBMCs中IKK mRNA對數水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖4 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對照組，兩組血液PBMCs中NF-κB mRNA對數水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖5 NMOSD急性期患者血清AQP4-Ab陽性為陽性組，陰性為陰性組，兩組脊髓MRI受累節段數比較，陽性組明顯增高P<0.05

圖6 NMOSD急性期患者血清AQP4-Ab陽性組中抗體滴度與脊髓MRI受累節段數關系，無相關關系P>0.05

3 討 論

B細胞是重要的體液免疫細胞，其功能異常時產生特異性AQP4抗體，并分泌多種炎癥因子，導致NMOSD發生，但具體發病機制尚不清楚。BCR是B細胞特征性標志之一， BTK激酶是BCR信號通路重要組成部分，表達于B細胞。 BTK通過激活下游核轉錄因子PI3K、 IKK、NF-κB信號通路，參與調控B細胞，介導B細胞成熟、增殖、分化，發揮免疫保護功能。研究表明，BTK/NF-κB信號通路中不同激酶異常激活后，參與自身免疫性疾病發生，但B細胞在NMOSD發病中的作用機制尚不清楚。

B細胞表達BTK增高可能會引起對BCR刺激的高度反應，而BCR信號通路的活化可以引起NF-κB信號通路的活化以及抵抗Fas介導的凋亡，引起B細胞活化和分化異常，從而參與的發病過程。類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)及原發性干燥綜合征(primary sjogren’s syndrome，PSS)患者的B細胞中，BTK蛋白和磷酸化BTK顯著增加[4]。系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者外周血BTK過表達會導致SLE樣疾病，產生自身抗體[5]。本研究表明，NMOSD患者急性期外周血PMBCs中BTK mRNA較對照組明顯升高，提示其參與了NMOSD發病。應用BTK抑制劑可顯著減緩SLE、RA的進展[6]。BTK抑制劑Ibrutinib可顯著降低小鼠CNS小膠質細胞和AS激活及促炎因子產生，改善CNS炎癥反應[7]。

PI3K激活的信號通路在協調促炎和抗炎通路等方面具有重要作用。PI3Kδ和PI3Kγ可作為抗炎治療的潛在靶點[8]，減輕SLE小鼠模型的疾病進展[9]。本研究中，PI3K mRNA在NMOSD患者中顯著升高，提示其參與了促炎病程。有數據顯示臨床試驗和臨床前小鼠模型表明，抑制PI3K/Akt信號通路可避免腫瘤惡化，及CNS炎癥和疾病進展[10]。

IKK、NF-κB是連接促炎信號通路與細胞存活、增殖和細胞因子產生的信號通路的中心樞紐。IKK是介導NF-κB通路激活的重要環節，NF-κB入核調控基因表達[11]，NF-κB在炎癥和自身免疫疾病中通過過度表達效應分子導致疾病進展[12]。IKKε可促進RA發展和炎癥發生[13]。在SLE小鼠模型中，抑制IKK/NF-κB通路，可減輕小鼠腎臟損傷[14]。Lee[15]等提出IKK/NF-κB誘導骨髓細胞活化，加劇EAE病情，特異性抑制劑可能將作為MS的免疫療法。Yang[16]等檢測NMOSD患者中IKK通路下的NF-κB基因表達較MS與正常對照組增高，與本研究一致。 由于多種刺激能激活NF-κB信號通路， 故必須精確控制NF-κB活性， 避免異常的免疫應答。 研究表明抑制BTK、NF-κB信號通路可顯著控制炎癥和減輕疾病[17,18]。

NMOSD典型的脊髓病變多累及3個或以上椎體節段，尤其是頸、胸段[19]。AQP4-Ab血清陽性患者比陰性患者脊髓損傷程度可能更為明顯[20]。多項研究提出AQP4-Ab陽性LETM的NMO轉化率較高，AQP4-Ab血清水平與脊髓損傷長度、大于3個節段以上病變的存在之間存在相關性[21,22]。本研究中，血清AQP4-Ab檢測陽性患者脊髓受累節段多于陰性患者，且≥3個節段者占70.83%，病灶多廣泛，多有脊髓腫脹，與多數研究者報道一致。而血清AQP4-Ab抗體滴度與脊髓受累節段數無線性相關關系，Isobe[23]等學者根據不同檢測方法均未發現AQP4-Ab滴度與臨床參數的相關性，與本研究一致，分析可能與一些患者體內AQP4-Ab滴度雖高但此次發病與ON有關而非脊髓炎。Kessler[24]等多中心隊列研究表明AQP4-Ab滴度對NMOSD患者臨床病程無預測作用。

本研究表明，NMOSD患者急性期外周血B細胞BTK、NF-κB、PI3K、磷酸化IKK表達水平較健康人明顯增高，表明BTK/NF-κB信號通路參與了NMOSD急性期B細胞的增殖、分化、抗體產生及炎癥的發生，可能在NMOSD發病中具有重要的作用，為尋找新的治療靶點提供了理論基礎。另外，NMOSD患者血清AQP4-Ab陽性可能提示脊髓受累節段較廣泛。