腦微出血合并認知功能障礙的相關性因素及與血清IL-18的分析

于美玉，焦卓敏，張雪梅，李矜玥，歐陽元嬌，李 薇，王 靜

腦微出血(cerebral microbleeds,CMBs)在影像學方面被定義為顱腦磁共振圖像(magnetic resonance images,MRI)的T2加權成像或磁敏感加權成像(susceptibility-weighted imaging,SWI)中直徑小于10 mm的、圓形的或類圓形的、性質相同的病灶[1]。CMBs是腦小血管病變的一部分[2]。近年來隨著我國老齡化社會的日趨明顯及頭部MRI及SWI的應用，CMBs被診出率也越來越高[3]。CMBs的危害逐漸引起醫學界的廣泛重視。CMBs可引起記憶力下降、認知能力障礙(cognition impairment,CI)、姿勢平衡障礙、情緒異常等臨床癥狀。可能在一定程度上影響認知功能障礙的發生和發展[4]，有研究表明CMBs是老年人認知功能下降常見原因[5]。目前研究顯示，CMBs與認知功能障礙有關，是血管性癡呆的主要危險因素[6]。CMBs在認知功能方面的意義引起了人們的廣泛關注。

1 材料和方法

1.1 研究對象 分析2017年12月-2018年10月在哈爾濱醫科大學附屬第二醫院接受診治的腦微出血患者80 例 (男45例，女35例)，正常對照組40例(健康男性、女性各20例)。所有CMBs患者均經磁共振檢查證實有CMBs病灶，所有健康對照組均經影像學顯示為無明顯異常。

入組標準包括：(1)患者18～85歲;(2)根據2014年《腦小血管病診治專家共識》診斷為CMBs[7];(3)患者意識清醒;(4)行頭部磁共振檢查(包括MRI、SWI);(5)無先天性認知功能障礙;(6)臨床資料相對完整者。

排除標準包括：(1)患者處于昏睡、昏迷或植物狀態;(2)患者病情發展較快或伴有嚴重并發癥;(3)患者存在嚴重語言功能障礙和/或雙側上肢運動功能障礙;(4)患者存在嚴重的視力和/或聽力障礙;(5)患者存在嚴重精神障礙、身體虛弱或其他情況(如對測試不能耐受或不合作者等);(6)患有嚴重的腦積水、腦出血、腦外傷及腦手術病史;(7)患有脫髓鞘病、腦代謝疾病、腦腫瘤等疾病。

1.2 研究對象分組 A組診斷標準：(1)由患者家屬提供信息或患者自身有認知功能衰退主訴者； (2)MMSE針對受教育年限認知功能障礙的劃界分為：文盲組≤17分、小學組≤20分、中學或以上組≤24分；根據Lees等[8]、Salvadori等[9]不同薈萃分析將MOCA量表評分初步劃分為：小學組及文盲組≤22分；中學或以上組≤26分。

B組診斷標準：(1)無認知功能衰退主訴者；(2)MMSE量表評分文盲組>17分、小學組>20分、中學或以上組>24分，或MOCA量表評分：小學組及文盲>22分、中學或以上組>26分；(3)認知功能總體表現正常者。 C組正常對照：門診健康體檢人群。

1.3 臨床資料收集 入院第1天對所有患者進行問卷調查，問卷內容包括：性別、年齡、職業、吸煙史(吸煙年限、每日吸煙量、是否戒煙)、嗜酒史(每周飲酒天數、平均每天飲酒量、飲酒年限、是否戒酒)、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史。所有患者入院36 h內于清晨空腹采靜脈血行下列指標檢查：空腹血糖、總膽固醇、血尿酸等。ELISA檢測試劑盒主要用于血清IL-18指標水平的檢測。接受診治的患者72 h內行3.0T磁共振檢查，MRI T1WI、T2WI及T2Flair、彌散功能呈像SWI橫斷位和T1WI矢狀位掃描。對于已確診CMBs患者進行認知功能量表測定，采用簡易精神狀態檢查(Mini-Mental State Examination,MMSE)及蒙特利爾認知量表(Montreal Cognitive Scale,MOCA)對受試者的認知功能進行快速篩查量表的所有項目均由本院兩位神經內科副主任醫師完成。

1.4 實驗室檢查 (1)所有患者入院36 h內于清晨空腹采靜脈血行下列指標檢查：空腹血糖、總膽固醇、血尿酸等;(2)ELISA檢測試劑盒主要用于血清IL-18指標水平的檢測。ELISA檢測試劑盒，方法如下：患者于入院72 h內采集血液，血標本置于EDTA試管內，2000 r離心10 min后取上清液，于-20 ℃冰箱凍存。使用上海優選生物公司提供的試劑盒、酶聯免疫吸附法測定血清IL-18水平。設置標準品孔及樣品孔，標準品孔各加不同濃度的標準品10 μl，血漿10 μl加入樣本孔，分別再加稀釋液40 μl稀釋。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的Klotho蛋白抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，在37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，于吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μl，15 min內，在450 nm 波長處測定各孔的OD值。所有結果均重復檢測3次。最后根據OD值計算濃度值，試劑均有原公司提供校驗品，進行有效的質控。

1.5 頭部磁共振檢查 接受診治的72 h內行3.0T磁共振檢查，采用德國Siemens MAGNETOM Verio 3.0T MR掃描儀。所有患者行頭部T1WI、T2WI及T2Flair、SWI橫斷位和T1WI矢狀位掃描。T1WI參數： TR 450 ms，TE 15 ms；T2WI 參數：TR 4000 ms，TE 120 ms；T2Flair參數：TR 7000 ms，TE 120 ms；SWI參數：TR 86.20 ms、TE 43.90 ms。根據患者病情需要再行各相冠狀位及矢狀位(除T1WI外)掃描，層厚3～6 mm，層間距0.3～0.6 mm。腦白質病變的評估，根據MRI T2或T2Flair序列，采用Fazekas量表[10]對腦室旁和深部白質病變分別評分，兩部分的分數相加計算總分(最低0分,最高6分)。腦微出血嚴重程度評估，采用微出血解剖評分量表(Microbleed Anatomical Rating Scale,MARS)，在T2加權的三維梯度回波序列計算CMBs數目(包括全腦CMBs、深部CMBs、腦葉CMBs以及幕下CMBs)。由經過培訓的神經科醫師、放射科醫師各一名進行采用雙盲法對所有影像資料進行分析，結果不一致時經協商后達成一致。

1.6 神經心理學的測評 對于已確診CMBs患者進行認知功能量表測定，采用簡易精神狀態檢查(Mini-Mental State Examination,MMSE)及蒙特利爾認知量表(Montreal Cognitive Scale,MOCA)對受試者的認知功能進行快速篩查量表均所有項目均由本院兩位神經內科副主任醫師完成。

2 結 果

2.1 CMBs患者一般臨床資料分析 本研究共收錄80例CMBs患者，男性45人，女性35人，正常對照組40例，男、女各20人。為了消除其他影響因素對試驗結果的影響，我們對A組與B組中的年齡、性別、吸煙、飲酒情況、高血壓、糖尿病及高脂血癥發病率進行了比較分析，結果發現，年齡、性別、吸煙、飲酒情況、高血壓、糖尿病及高脂血癥發病率在兩組間差別均無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 CMBs組與影像學結果的關系 影像學顯示側腦室旁腦白質病變與CMBs合并認知功能障礙明顯相關，且腦白質病變越重，認知功能障礙越明顯，具有統計學意義(P<0.05)；CMBs數量與CMBs合并認知功能障礙明顯相關，且數量越多，認知功能障礙越明顯，具有統計學意義(P<0.05)。而CMBs部位及大小與CMBs合并認知功能障礙無明顯相關性(P>0.05)(見表2)。

2.3 血清IL-18水平與CMBs及CMBs合并認知功能障礙的關系 CMBs組(A組與B組共同組成)中血清IL-18(72.44±14.38)pg/ml水平明顯高于C組(50.07±22.02)pg/ml，且差異具有統計學意義(P值<0.05) (見表3)；A組IL-18水平(76.85±11.46)pg/ml高于B組(67.92±15.75)pg/ml，差異具有統計學意義(P<0.05) (見表3)。

2.4 CMBs組神經心理學測評比較 在MMSE量表顯示，CMBs主要與定向力、注意力與計算力、回憶、語言明顯相關，具有統計學意義 (P<0.05)，而與記憶力無明顯相關，無統計學意義(P>0.05)。MoCA量表顯示，CMBs主要與定向力、注意、語言、視空間與執行力、命名明顯相關，具有統計學意義(P<0.05)。而與抽象、延時回憶無明顯相關性，無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表1 CMBs組是否合并認知功能障礙患者基本情況比較

注：A組：CMBs組合并認知功能障礙組；B組：CMBs組無認知功能障礙組；P<0.05具有統計學意義

表2 CMBs是否合并認知功能障礙的影像學比較

注：A組：CMBs組合并認知功能障礙組；B組：CMBs組無認知功能障礙組；Fazekas評分：腦室旁和深部白質病變分別評分；SWI：磁敏感加權成像；CMBs：腦微出血；MARS：微出血解剖評分量表；P<0.05具有統計學意義

表3 CMBs組、CMBs合并認知功能障礙組與正常對照組IL-18水平的比較

注：A組：CMBs組合并認知功能障礙組；B組：CMBs組無認知功能障礙組；P<0.05具有統計學意義

表4 神經心理學的測評

注：A組：CMBs組合并認知功能障礙組；B組：CMBs組無認知功能障礙組；MMSE：簡易智力狀態量表；MoCA:蒙特利爾認知量表；P<0.05具有統計學意義

3 討 論

3.1 CMBs患者臨床基本資料分析 CMBs與腔隙性腦梗死、腦白質病變、血管周圍間隙擴大都屬于腦小血管病變疾病范疇，并且作為腦小血管疾病的一種影像學標志。目前大部分研究認為CMBs病變是血液成分的外滲，含鐵血黃素及吞噬有含鐵血黃素的巨噬細胞形成微小集合灶[1,11]。有研究認為腦動脈硬化導致腦微血管脆性增加[12,13]，極容易出血。也有研究認為在顱內血管發生閉塞，由于血流代償機制也可造成患者出現CMBs性損傷。關于CMBs發病機制及發病危險因素目前尚無定論。有研究對部分導致CMBs發生的危險因素進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示：CMBs的發生可能與高齡、性別、高血壓病、2型糖尿病、淀粉樣血管病、腦白質變性、血脂異常、服用抗血小板聚集藥物、使用抗凝藥物及吸煙等因素有關[14]。由于CMBs癥狀隱匿，不易被早期發現，但是一旦出現癥狀后常無法治愈，可能逐漸出現記憶減退、頭暈、共濟失調等輕度癥狀，尤其以短時記憶減退癥狀明顯，一些隱匿性癥狀可能隨時間逐漸加重，也可以隨著每次腦卒中的發生而突然加重，甚至嚴重影響患者的認知功能。我們入組的CMBs患者分析結果顯示影響CMBs發生認知障礙患者的年齡、性別、個人史等人口學資料及高血壓、糖尿病、高脂血癥等臨床基本資料無明顯相關性，這可能是由于我們的樣本數據過少導致的。但是我們推測年齡、性別、個人史、高血壓、糖尿病、高脂血癥等危險因素也有可能是影響CMBs患者認知功能的相關危險因素。下一步需要擴大樣本量進行研究。

3.2 CMBs與影像學的關系 大部分患者的CMBs病灶一般無明顯臨床癥狀，一旦出現可以察覺的癥狀，會大大降低對于疾病的控制效果，對于患者來說是一個隨時潛在的危險，因此患者及時行影像學檢查是非常必要的，不僅能夠提高CMBs檢出率，還對于CMBs患者的早期診斷、早期干預、早期治療具有較大的臨床指導意義。

目前臨床上常用于MRI成像序列主要為T2梯度回波序列 (T2-GRE) 和磁敏感加權呈像(SWI序列)的掃描檢查方式檢測CMBs，尤其是SWI序列已逐漸成為檢測CMBs的標準序列[1,3,15]。然而因其成像及后處理時間較長，因此大多數醫院為不將SWI序列作為常規掃描序列。本研究為了更好的顯示出CMBs的存在并且排除腦部其他疾病，如腦梗死、煙霧病、CADASIL等，患者除常規行MRI軸位T2WI序列外，還進行了SWI序列檢查。由于MRI軸位T2序列對于腦白質病變更加敏感，本研究選擇MRI軸位T2WI序列可觀察腦白質病變的大小及程度，利用Fazekas評分[10](其中腦室旁和深部白質病變分開評分)對腦白質病變嚴重程度進行比較，T2WI序列雖然也可以顯示出部分CMBs，但病灶顯示并不完全，一些小的點狀微出血灶甚至無法顯示或者辨認，所以我們結合了SWI序列觀察患者CMBs病灶情況，SWI序列掃描模式在對CMBs檢查中不僅能夠清楚顯示微出血灶，而且在顯示病灶的數目及直徑等方面均顯著多于或大于其他MRI序列，因為在人體內，血液常為順磁性物質，當出現微血管變性出血時，紅細胞被巨噬細胞吞噬導致含鐵血黃素聚集，當患者出現CMBs時常有信號缺失，所以SWI對于患者CMBs檢出率較其他檢測手段檢出率更高，可用于確診CMBs，也為本研究的入組標準提供了可靠依據。我們的結果顯示了側腦室旁腦白質病變程度越重、CMBs數量越多，CMBs合并認知功能障礙程度越重。

3.3 CMBs與IL-18的關系 白細胞介素-18(IL-18)基因位于第11號染色體上，IL-18由巨噬細胞等誘導產生，屬于促炎細胞因子，由IL-18基因編碼的蛋白質廣泛存在于人類中。IL-18存在于白細胞介素-1(IL-1)超家族的細胞因子，IL-18能夠誘導產生嚴重的炎癥反應，在某些炎性疾病中具有重要作用。有研究顯示，IL-18促炎癥作用下可以影響老年人的認知功能[16]。但目前關于IL-18與CMBs及CMBs合并認知功能障礙發生的臨床研究罕見報道。本研究結果證明，IL-18水平越高，CMBs組明顯升高，且在CMBs合并認知功能障礙組中更加明顯。IL-18水平升高，不僅可以加重CMBs疾病發生，而且可以作為CMBs患者合并認知功能障礙影響程度重要指標。IL-18做為一種應激蛋白是能夠誘導Th1細胞產生細胞因子同時促進NK細胞毒活性，促進T細胞增殖的物質，IL-18可以激活其他多種炎性因子，參與應激和多種免疫機制炎癥反應過程[17]。因此IL-18的外周水平升高可能反映了疾病干擾中樞免疫相關穩態變化，有研究顯示IL-18水平升高可能提示患者體內的神經細胞處于損傷狀態，有局灶性或全身性炎癥的發生，這意味著與患者體內的病變神經細胞的營養狀態密切相關，還可能累及多種信號途徑發生改變，如：下丘腦-垂體-腎上腺素軸等。患者在IL-18水平升高后，還可能表現出減弱對神經細胞損傷的修復能力，以及影響神經細胞的信號傳遞功能，這些均與IL-18的炎性作用直接密切相關。當IL-18進入神經系統后，一方面如果適度的IL-18炎性反應表達可以對于神經細胞內環境的維持與穩定具有一定的保護作用;另一方面如果炎性反應表達過度將影響正常神經細胞的成熟過程，正常神經細胞的成熟通常情況下需要炎性小體和轉化酶的輔助和參與，所以炎性小體的成熟和活性大小對于保護、維持神經內環境正常功能或因其過表達導致損傷神經細胞內環境穩態與否具有關鍵性的作用[18,19]。IL-18可能更容易通過炎性小體發揮對神經細胞的損傷作用，導致神經系統功能的失調。有文獻報道IL-18可以在一定程度上改變患者糖皮質激素及其受體的含量和表達水平，引起神經元功能和結構發生改變，這些改變共同促使CMBs的形成。因此在人體內高表達的IL-18可能是病變嚴重程度的重要客觀指標，CMBs的形成有一定促進作用，可能是預示CMBs形成的客觀指標。表明IL-18的水平升高對于導致患者認知功能障礙的鑒別與診斷方面是極其重要的。說明IL-18的升高很可能是造成CMBs患者出現認知功能下降以及出現相應病理結果的原因。

3.4 CMBs與認知功能的關系 CMBs患者影響認知功能的主要表現在對外界信息處理速度明顯減緩、有效的注意力持續時間減少、語言流利程度顯著降低等執行功能減退等癥狀，起病隱匿，癥狀進展緩慢。在認知功能障礙患者眾多篩查量表中，簡易智能精神狀態量表(MMSE量表)簡單易行，在國內外應用最為廣泛，是篩查認知功能障礙及癡呆量表的首選，此量表中包含有視空間、定向力、計算力、語言、注意力、記憶5個方面內容，可以全面、迅速且準確地反映受試者的智力狀況及認知功能缺損情況。MoCA量表注重對受試者執行能力的認知功能及注意力的評價，故本研究結合MoCA量表及MMSE量表篩查受試者的認知功能。

Seo等[20]在皮質下血管性癡呆的患者中研究了CMBs對多重認知域的獨立影響，結果提示CMBs不僅能夠影響執行功能，還對記憶、語言以及視空間功能有著同樣的影響。本研究顯示CMBs患者，在認知領域主要影響定向力、注意、語言功能。CMBs對于認知功能的影響已經明確，但是我們還需要進一步研究影響認知功能機制，才能更好的從根本改善CMBs帶來的認知功能方面的影響。

總之，我們已經確定了許多CMBs合并認知功能障礙的相關性因素，對于CMBs合并認知障礙的影像學檢查在臨床實踐中應充分發揮各種MRI序列的優勢，如：聯合應用SWI序列、DWI序列圖像與常規MRI序列,用以排除小靜脈、鈣化、血管周圍間隙、海綿狀血管瘤、軟腦膜含鐵血黃素沉積的低信號的干擾，提高患者CMBs檢出率和檢出量，可以早期發現無癥狀CMBs，這對于患者CMBs合并認知障礙早期診斷、早期干預具有巨大幫助。并且研究了CMBs患者合并認知功能障礙的患者與血清IL-18之間的相關性，我們發現血清IL-18水平對于CMBs合并認知功能障礙的患者具有重要意義，此項結果可有利于加深臨床上對CMBs的診治認識，因而可依據上述研究結果排除不合理方案進而制定合理的診療方案，降低CMBs可能發生的風險。同時我們的研究顯示IL-18的外周水平升高可能反映了疾病干擾中樞免疫相關穩態變化，這表明IL-18的升高對于導致患者認知功能障礙的鑒別與診斷方面是極其重要的，可作為對CMBs患者早期診斷認知功能障礙的生物學標志。而對于患者神經心理學的測評表明CMBs合并認知能力障礙的患者主要選用MoCA量表及MMSE量表篩查受試者的認知功能。結果顯示在MMSE量表中，主要與定向力、注意力、計算力、回憶、語言明顯相關，而與記憶力無明顯相關。而在MoCA量表中主要與視空間與執行力、命名、注意、語言、定向力明顯相關。而與抽象、延時回憶無明顯相關，這對于臨床診斷以及判斷病情變化具有極其重要的意義，當然我們的實驗因為時間及條件的限制還有很多的局限性,比如：加用其他量表可能將得到更加全面的數據評估，以及減少在量表評定中可能存在各式各樣的誤差，在控制變量上我們所選擇的試驗項目還應更加嚴格，對于其他學科的可能存在實驗項目的交叉應該加以注意甄別，同時對于樣本的數量如有必要還應繼續收集，以增加試驗組以及對照組的容量。但是我們可以預期，對于CMBs合并認知功能障礙的患者選擇SWI序列、T2序列、MMSE量表及MoCA量表篩查以上檢查方式以及上述結果能夠提高臨床醫生對于患者的診斷準確性，并據此選擇合理醫療方案，及時治療患者疾病，延緩患者疾病發展，降低死亡率，值得臨床大力推廣。

該試驗通過應用MMSE量表、MoCA量表評分對CMBs患者認知功能下降程度進行分組，并將CMBs患者中的IL-18進行單獨研究，對比組間相關性因素、腦白質病變、CMBs的數量的差異，得出CMBs人群中，IL-18水平、側腦室旁腦白質病變程度、CMBs數量與認知功能有關。CMBs人群中，人口學及高血壓、糖尿病、高脂血癥等危險因素對于CMBs患者的認知功能影響并不明顯，但是我們也應當重視高血壓、糖尿病、高脂血癥對于CMBs患者的認知功能的影響。因此在臨床上我們應重視CMBs對于認知功能的影響，及早干預從而減慢CMBs病變的進展。本研究樣本量較小，可能導致結果不完全準確，需要擴大的樣本量進一步研究驗證。