紅景天苷對呋喃所致小鼠肝損傷的保護作用研究

李釔，蹇瑜璇，竇 純，吳 璇，閆海洋，袁 媛

（吉林大學食品科學與工程學院食品質量與安全系，吉林長春 130062）

呋喃（分子式為C4H4O），是一種具有芳香味與低沸點（31℃）的小分子環狀烯醚，具有高度揮發性、親脂性且具有毒性。它容易通過生物膜，被肺或腸吸收，可在人體中引起腫瘤或癌變[1]。國際癌癥研究機構將呋喃列為可能使人類致癌物質的2B組[2]。瑞典公共健康管理局和加拿大等國家的許多研究也發現了呋喃潛在的致癌危險。美國國家毒理學計劃研究表明，對于多種器官，呋喃都有較強烈的致癌作用，它可以導致肝臟和腎臟損傷，造成毒性病變，并且它所造成的損傷程度與其劑量成正比。

紅景天藥用歷史久遠，最早見載于公元1200年的藏醫《四部醫典》中，言其“性平、味澀、善潤肺、能補腎、理氣養血”[3]。紅景天苷是藏藥紅景天的主要活性成分，化學名為對羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，苷元為對羥基苯乙醇，即酪醇（Tyrosol）[4]。紅景天苷具有多重生物學作用，如抗疲勞、抗衰老、抗缺氧作用、心臟保護作用、腦保護作用、神經保護作用、保肝護腎、抗肺損傷、皮膚保護等[5-7]。另外，也能清除自由基、抗氧化，具有抗癌和抗細胞凋亡作用、抗炎和抗毒素作用、抗骨質疏松和糖尿病作用。目前已有研究證實紅景天苷對肝臟有一定的保護作用。榮黎等人[8]研究表明，紅景天苷可使大鼠血清肝功指標得到改善，降低肝組織丙二醛（Malondialdehyde，MDA） 含量、提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 活性，減輕肝組織病理學變化。韓洪波等人[9]證實紅景天苷對腎炎大鼠有治療作用。潘志浩等人[10]建立CCl4大鼠肝損傷模型，對病鼠進行紅景天灌胃處理。結果表明，紅景天苷對抗肝纖維化有一定作用，能夠減緩CCl4對肝臟造成的損傷。

肝臟是機體新陳代謝的中心站，是藥物、氧化性毒物及體內某些代謝產物最主要的靶位點，各種物質以肝實質或非實質細胞作為靶細胞，激發細胞損傷，產生細胞壞死、凋亡、炎癥、纖維化等一系列病理變化[11]。肝組織HE切片也是判斷肝臟病變及健康狀況的重要材料。

通過研究呋喃和紅景天苷對小鼠肝臟的氧化指標丙氨酸氨基轉移酶 （Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽-S轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）、MDA、SOD，以及免疫指標腫瘤壞死因子 -α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素 -6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（interleukin-10，IL-10） 含量變化的影響，結合肝組織HE切片分析，探究紅景天苷對由呋喃所致的小鼠肝損傷的保護作用，為減輕食品中呋喃在人體內產生的損害作用提出新的解決途徑，從而達到提高人體健康水平的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 氧化指標測定

丙二醛（MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD） 測定試劑盒、谷胱甘肽-S移換酶（GST）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒、谷丙轉氨酶（ALT）測定試劑盒、谷草轉氨酶（AST） 測定試劑盒。

1.1.2 免疫指標測定

小鼠白細胞介素6（IL-6）、小鼠白細胞介素10（IL-10）、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α） 檢測試劑盒。

1.1.3 蛋白含量測定

總蛋白定量測定試劑盒（BCA），南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 其他

無菌生理鹽水、玉米油、呋喃標準品（CAS：110-00-9，純度≥99.5%）、紅景天苷 （CAS：10338-51-9，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司提供；25只Balb/c雄性小鼠，遼寧長生生物技術有限公司提供。

1.2 儀器與設備

JD200-3型萬分之一電子天平，北京北德科學器材有限公司產品；RT-6000型酶標分析儀、Spx-250B-Z型37℃恒溫培養箱、HH-8型數顯恒溫水浴鍋，上海博訊有限責任公司產品；MixMax型漩渦混勻器，北京北德科學器材有限公司產品；LD5-2A型離心機，北京醫用離心機廠產品；超純水Milli-Q system高壓滅菌鍋；干熱消毒箱；超凈臺。

試驗耗材：1 mL灌胃裝置、1 mL一次性使用無菌注射器、解剖工具、玻璃研磨器、小號鼠籠及給水瓶、移液槍等。

1.3 方法

1.3.1 試驗溶液的配制

（1）空白組試劑的配制。直接取用玉米油和生理鹽水。

（2） 質量濃度8 mg/mL呋喃溶液的配制。用萬分之一天平準確稱量0.06 g呋喃標準品，溶于15 mL玉米油中，混勻，配置成40 mg/mL的溶液，之后取2 mL質量濃度40 mg/mL的呋喃加到8 mL玉米油中，混勻，配成質量濃度8 mg/mL的溶液，以上操作全部現用現配、冰上操作。

（3） 質量濃度40 mg/mL紅景天苷溶液的配制。用萬分之一天平準確稱量0.06 g紅景天苷，溶于15 mL生理鹽水中，混勻，配制成40 mg/mL的溶液。

（4） 質量濃度20 mg/mL紅景天苷溶液的配制。取質量濃度40 mg/mL的紅景天苷溶液，加入2倍體積的生理鹽水得到質量濃度20 mg/mL的溶液。

（5）質量濃度10 mg/mL紅景天苷溶液的配制。取質量濃度20 mg/mL的紅景天苷溶液，加入2倍體積的生理鹽水得到質量濃度10 mg/mL的溶液。

1.3.2 動物的分組

25只Balb/c雄性小鼠，體重20±3 g，隨機分為5組，每組5只，分別放入5個鼠籠，在溫度為18～22℃，相對濕度為50%～60%的條件下飼養。自由覓食飼養1周，待小鼠完全適應環境后，進行動物試驗。所有的操作和試驗流程均遵守我國《實驗動物管理條例》。

小鼠適應環境后，首先將無菌小鼠隨機分為5組，分別為空白組，呋喃組（8 mg/kg/d），紅景天低（10 mg/kg/）、中（20 mg/kg/d）、高（40 mg/kg/d）劑量組。除空白組用玉米油灌胃外，其余各組均進行呋喃灌胃。采用上述步驟處理15 d后，在每組中隨機取出1只小鼠觀察病變情況，若所取小鼠均病變，則建模成功。若建模失敗，除空白組外各組繼續用呋喃灌胃15 d，再次檢測，直到建模成功。成功后，每天要進行2次灌胃。空白組作為對照組，要求連續15 d每天上午用玉米油灌胃，下午用生理鹽水灌胃；呋喃染毒組連續15 d每天上午用8 mg/mL的呋喃溶液灌胃，下午用生理鹽水灌胃；紅景天苷保護組連續15 d每天上午用8 mg/mL的呋喃溶液灌胃，下午分別用10，20，40 mg/mL的紅景天苷溶液灌胃。灌胃時間為每天上午8:00-9:00，下午3:00-4:00。試驗期間，每天記錄小鼠的體重，并根據體重給予呋喃和紅景天苷的劑量，密切觀察小鼠的體型、體重、飲食習慣和日常活動的變化情況。待給藥階段完全結束后，將所有小鼠麻醉處死，取其肝臟和血液進行指標測定。

1.3.3 小鼠處理及血清的制備

試驗進行30 d，最后一次給藥結束，斷食。12 h后處死小鼠。將小鼠麻醉后，用眼球取血法取小鼠外周血，用EP管收集。將EP管放在4℃環境中靜置1～2 h，待血清析出后以轉速3 000～4 000 r/min，溫度4℃條件下冷凍離心10 min，吸取上層血清部分，于4℃下儲存，待進一步指標分析。

1.3.4 小鼠組織勻漿的制備

用脫脊椎法處死小鼠后，立即在超凈工作臺上解剖取出肝臟組織，用生理鹽水洗去表面血跡和雜毛，濾紙擦干后稱質量。按肝臟質量∶體積=1∶9量取預冷的生理鹽水，一并加入預冷的玻璃勻漿機中，冰浴研磨至無組織塊，制成10%的組織勻漿。勻漿放于離心機內以轉速3 000 r/min離心15 min，取上清液待測，若不澄清或澄清不徹底應再次離心。

1.3.5 小鼠氧化指標的測定

嚴格按照試劑盒說明測定小鼠肝組織中MDA，SOD，GSH-Px，GST的含量，以評定小鼠氧化損傷狀況。按照試劑盒說明測定小鼠血清中AST，ALT的含量，結合測定結果評定小鼠肝臟的健康狀況。

1.3.6 小鼠免疫指標的測定

嚴格按照試劑盒說明測定小鼠血清中的TNF-α，IL-6，IL-10的含量，以評定小鼠免疫功能的變化情況。

1.4 計算

應用SPSS 16.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差表示，p＜0.05為差異具有統計學意義。試驗數據均使用Origin繪圖軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 小鼠肝組織HE切片及分析

Furan誘導肝損傷小鼠肝組織病理學觀察結果（400×） 見圖1。

圖1 Furan誘導肝損傷小鼠肝組織病理學觀察結果（400×）

中毒等急性病理過程會導致肝臟出現空泡變性、嗜酸性變、細胞核異型性、變性壞死等病變情況，根據不同組別切片中肝臟的病變情況判斷小鼠的肝臟損傷程度，從而探究紅景天苷對呋喃所致肝損傷的保護作用。

空白組小鼠的肝切片出現透明泡，應為空泡變性或者脂肪變性，原因可能為空白組小鼠灌胃玉米油造成脂肪攝入過多，無法完全代謝。空白組大部分肝臟組織健康正常，無其他病變。呋喃染毒組小鼠肝臟切片顯示，肝臟出現脂肪變性或空泡變性，嗜酸性變明顯，炎細胞浸潤現象突出，并且出現了明顯的組織壞死現象，肝組織損傷情況嚴重。紅景天苷低劑量組的小鼠肝臟有空泡變性和嗜酸性變，嗜酸性變仍較為嚴重，炎細胞浸潤現象也十分明顯，但病變情況較呋喃組相比有一定程度的減輕。紅景天苷中劑量組中的小鼠肝切片嗜酸性變，伴有空泡變性和炎細胞浸潤，炎細胞浸潤現象仍較明顯，有減輕趨勢。紅景天苷高劑量組小鼠肝切片的嗜酸性變明顯減弱，幾乎消失，炎細胞浸潤明顯。嗜酸性變與肝臟損傷有關，損傷程度越深，嗜酸性變得越強烈。呋喃組小鼠的肝臟損傷最強烈，紅景天苷組小鼠肝臟損傷程度隨紅景天苷濃度增高呈降低趨勢。

2.2 小鼠體內氧化指標的測定結果及分析

小鼠體內氧化指標測定結果見表1。

ALT和AST均為非特異性細胞內功能酶，是臨床上常用的肝功能評價指標[12]。ALT和AST主要分布在肝細胞內，正常情況下，二者在血漿中的含量相對穩定且較低，但當肝細胞發生變性或壞死時ALT，AST含量就會升高，其升高的程度與肝細胞的受損程度相一致[13]，試驗將AST，ALT這2個指標作為判斷肝損傷的重要數據。由表1可知，呋喃染毒組的小鼠肝臟中AST，ALT含量明顯高于空白組和紅景天苷組。并且隨著紅景天苷濃度的升高，血清中AST和ALT的含量逐漸下降。呋喃染毒組中的AST和ALT水平高，說明呋喃導致肝細胞膜通透性改變，AST，ALT釋放進入了血漿中，肝組織出現炎癥、腫脹或壞死等損傷現象，而紅景天苷對這一損傷有顯著的保護作用，且這種保護作用隨紅景天苷劑量的增加而增強。

表1 小鼠體內氧化指標測定結果

GSH-Px能夠催化還原型谷胱甘肽與ROS反應，保護生物膜免受ROS的損害。它還具有保護肝臟、提高機體免疫力的功能。GST是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統。二者含量的下降表明肝臟解毒和抗氧化損傷能力下降，肝臟受損。由表1數據計算得，呋喃染毒組的GSH-Px與空白對照組相比下降了47.80%，GST水平下降了57.17%，紅景天苷保護組的GSH-Px和GST水平較呋喃染毒組有所回升，并且回升程度與紅景天劑量有關。因此，紅景天苷可以通過增加肝臟中GSH-Px，GST的水平，增加生物體抗氧化和解毒的能力，改善由呋喃引起的肝臟氧化損傷。

自由基可與肝細胞內的蛋白質等大分子進行共價結合，干擾蛋白質的合成，也可與肝細胞膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，導致肝細胞內SOD過度消耗，MDA大量產生，同時破壞肝細胞膜結構和功能的完整性，使膜通透性升高，導致肝細胞腫脹壞死，肝細胞破損后釋放ALT，AST滲入血液而活性升高[14-16]。自由基是導致機體氧化損傷的直接原因。MDA為脂質過氧化的產物，可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹壞死。它既能反映體內氧化反應，也可以作為損害因子對機體造成損傷[17]，因此測定肝臟中MDA的量可以反映出機體氧化損傷的程度。SOD是生物體內重要的活性物質，能夠清除機體內的自由基。SOD首先催化超氧陰離子生成氧氣和過氧化氫，生成的過氧化氫在GSH-Px的催化下轉換成H2O和O2[18]。SOD能夠保護細胞免受損傷，間接地反映了機體清除體內氧自由基的能力[19]。由表1可知，呋喃染毒組和紅景天苷保護組的SOD水平顯著低于對照組，MDA水平高于對照組，這說明呋喃使小鼠肝臟受到了一定程度的氧化損傷。在紅景天苷的作用下，小鼠肝臟內的SOD水平有所回升，紅景天苷低劑量組中的SOD比染毒組上升了32.83%，紅景天苷中劑量組中的SOD比染毒組上升了54.08%，紅景天苷高劑量組中的SOD比染毒組上升了102.37%。由此可見，紅景天苷可以通過顯著提高肝臟中SOD的水平來清除增多的氧自由基，減緩呋喃引起的肝臟的氧化損傷，且保護作用與紅景天苷劑量呈正相關。呋喃組MDA水平高，脂質過氧化程度增加，肝臟受損。紅景天苷處理后，肝臟MDA濃度顯著降低，且呈現了與劑量的正相關，說明紅景天苷處理可以有效改善呋喃導致的肝損傷。

2.3 小鼠體內免疫指標的測定結果和分析

小鼠血清中TNF-α的含量變化見圖2，小鼠血清中IL-6的含量變化見圖3，小鼠血清中IL-10的含量變化見圖4。

圖2 小鼠血清中TNF-α的含量變化

圖3 小鼠血清中IL-6的含量變化

圖4 小鼠血清中IL-10的含量變化

在肝臟損傷的過程中炎癥被激活是一種常見的病理生理過程[20]。TNF-α，IL-6是重要的免疫反應調節因子。TNF-α是一種由單核細胞和巨噬細胞產生的單核因子，具有促炎作用[21]，是多種信號通路的關鍵環節。IL-6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。IL-10是由活化的免疫細胞產生的關鍵抗炎細胞因子[22]，肝臟中許多細胞都能分泌IL-10，其具有消除炎癥的作用[23]。

由圖2和圖3可知，呋喃染毒組血清中TNF-α，IL-6含量與空白對照組相比，有顯著性增加（p＜0.05）；說明呋喃刺激小鼠產生免疫反應，對小鼠機體有一定毒害作用。紅景天苷相關劑量組中TNF-α，IL-6含量與呋喃組相比，有顯著性減少（p＜0.05），減少程度與紅景天苷劑量成正比。這說明紅景天苷對小鼠血清中TNF-α，IL-6分泌有明顯抑制作用，且抑制作用隨著劑量增高而增強，即紅景天苷能夠抑制呋喃引發的免疫反應。由圖4可知，IL-10作為炎癥與免疫抑制因子，在呋喃染毒組的含量遠遠低于空白組，給予了不同劑量的紅景天苷后，呋喃染毒組的含量上升，說明呋喃可以引發機體炎癥，而紅景天苷可以通過抑制促炎因子、提高體內炎癥抑制因子的分泌來調節機體免疫，清除呋喃的損傷作用。

3 結論

作為食品加工過程中產生的污染物，呋喃具有潛在的致癌性。通過小鼠的肝臟HE切片可知，呋喃的作用能夠使小鼠肝臟發生氧化損傷，主要表現為肝細胞空泡變性、嗜酸性變、空化、炎細胞浸潤和細胞核異型性，少部分肝臟可能出現組織壞死的現象。給予紅景天苷的小鼠，肝臟的病變情況減輕，且減輕程度與紅景天苷劑量呈正相關趨勢。這說明紅景天苷能在一定程度上減少呋喃使肝臟發生的病理性損傷。同時呋喃導致小鼠機體內AST，ALT，MDA含量升高，SOD，GSH-Px，GST含量下降，說明呋喃會引發小鼠肝臟的氧化損傷，相關抗氧化酶活力降低，清除自由基效率明顯下降。而紅景天苷各劑量組的小鼠中AST，ALT，MDA水平低于呋喃組，SOD，GSH-Px，GST含量有所回升，表明紅景天苷可以減少肝細胞膜通透性的改變，有效提高了肝臟組織內清除自由基的能力，減少肝臟的氧化損傷。

免疫指標TNF-α，IL-6，IL-10的變化反映肝臟的免疫狀態。TNF-α，IL-6是重要的免疫反應調節因子。含量越高，免疫強度越大，肝臟受損傷越嚴重。IL-10是重要的炎癥與免疫抑制因子，含量越低，機體抵抗炎癥侵襲的能力越弱，免疫能力越低下，受損傷越嚴重。呋喃組小鼠血清中TNF-α，IL-6含量顯著高于空白組，而IL-10含量遠遠低于空白組，呋喃導致小鼠肝臟受損較嚴重。然而紅景天苷灌胃小鼠后能明顯抑制淋巴因子TNF-α，IL-6的分泌，促進IL-10的分泌，從而表現出紅景天苷具有明顯調節和增強機體免疫力的功能。

小鼠肝臟組織切片、氧化指標、免疫指標為一個整體，由臟器到分子水平提示紅景天苷對呋喃導致的小鼠肝損傷有一定的保護作用，并且這種保護作用和紅景天苷的劑量呈正相關關系。紅景天苷可能通過提高機體抗氧化酶活性，減輕自由基對細胞膜造成的損傷，同時也有試驗結果表明紅景天苷可以調節機體的免疫反應，因此紅景天苷對由呋喃引發小鼠肝損傷的保護作用可能是通過多條途徑實現的。