CLDN4促進胃癌細胞增殖和侵襲能力

鄭文英 楊文娟 鄧敏(通訊作者)

510095廣州醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所廣州惡性腫瘤治療轉化醫學重點實驗室

胃癌的發病率居全球惡性癌癥的第4位，死亡率在癌癥中排第2 位。我國是胃癌發病率和死亡率最高的國家，并且發病率呈逐年增加趨勢[1]，對人類健康造成嚴重威脅。胃癌目前的治療方式主要是以手術為主，輔以化療或放療。手術是現在唯一可以根治胃癌的治療手段，但是大部分胃癌被確診已為中后期，且多發生轉移，腫瘤發生全身轉移常導致患者無法進行根治性手術，因此轉移是導致患者死亡的主要原因之一。所以，針對胃癌早期診斷和轉移機制的研究是臨床非常重要的課題。CLDN4 屬于緊密連接蛋白家族成員。研究發現，CLDN4 在包括食管癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中存在高表達現象，并且其過表達與腫瘤預后不良相關[2]。本研究旨在研究CLDN4在胃癌的作用。

資料與方法

材料與試劑：人胃癌細胞系SGC7901、RPMI1640 培養基、小牛血清、Lipofectamine 2000 脂質體、TRIzol RNA 抽提試劑盒、RNA 逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR儀等。

圖1 MTS 檢測轉染CLDN4 siRNA 及對照細胞的增殖情況

圖2 transwell 細胞侵襲實驗檢測轉染CLDN4 siRNA及對照細胞的侵襲能力

方法：①細胞培養：使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養基培養。細胞放置于37℃、5%CO2培養箱中培養。②細胞轉染：將細胞轉染前1 d 接種于6 孔板中，待貼壁細胞融合度達70%～80%時，用無血清培養基根據Lipofectamine 2000說明書進行轉染。轉染后6 h換新鮮完全培養基，繼續擴大培養以用于后續實驗。③qRT-PCR 檢測：用TRIzol 提取細胞的總RNA，采用Takara 逆轉錄試劑盒按照說明書進行逆轉錄。PCR反應體系如下：2X SYBR Green Master mix 10 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，Cdna 2 μL，無酶水7 μL。采用ABI 7500 fast 實時定量PCR 儀進行PCR 反應，反應條件：Cycle 1：(1×)，95℃30 s；Cycle 2：(40×)，95℃5s，60℃30s。④MTS法檢測細胞增殖活性：將細胞接種于96 孔板中，每組設6個復孔。細胞接種后24 h、48 h、72 h后分別加20 μL MTS檢測試劑，37℃培養3 h，用酶標儀測定570 nm 波長吸光度值。⑤transwell細胞侵襲實驗用胰酶消化細胞，用無血清培基重懸細胞，細胞計數。在transwell 下室加入含15% FCS 的培基700 μL。在transwell 上室加入細胞懸液250 μL，培養48 h，溫度控制在37℃。取出transwell，擦掉靠上室側膜的細胞，用10%福爾馬林中固定10 min，結晶紫染色，顯微鏡細胞計數。

統計學方法：采用SPSS 19.0 統計學軟件分析數據。計量資料(±s)表示，采用t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

在SGC7901 細胞中轉染CLDN4 siRNA 后，通過qRT-PCR 檢測細胞CLDN4 表達水平，發現可轉染CLDN4 siRNA 顯著降低細胞CLDN4 表達水平，說明干擾效率高。檢測轉染CLDN4 siRNA 及對照細胞的增殖情況發現，轉染CLDN4 siRNA 細胞較對照細胞增殖速度明顯減慢，差異有統計學意義(P＜0.05)。隨后通過transwell 細胞侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力，發現轉染CLDN4 siRNA 細胞的侵襲能力顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。這些結果說明CLDN4 能促進胃癌細胞增殖、侵襲能力，見圖1和圖2。

討 論

胃癌是人類十大惡性腫瘤之一，是消化系統最常見的惡性腫瘤，其死亡率在所有癌癥中排第2 位，每年約有70 萬人死于胃癌，嚴重威脅著人類健康。胃癌的發生發展機制尚不十分清楚，一般認為胃癌是一個涉及多步驟、多階段、多基因改變的復雜過程，包括抑癌基因的失活、原癌基因的激活以及錯配修復基因的突變等。胃癌的易感因素多種多樣，主要是環境、遺傳和行為三者之間的相互作用。關鍵的環境因素是慢性感染幽門螺旋桿菌，特別是CagA菌株。目前對胃癌具體發病及轉移機制仍有很多尚待明確的地方。

已有研究顯示，CLDN4 在胰腺癌中呈現高表達，并且與腫瘤分級有關[3]。然而在胰腺癌細胞過表達CLDN4 抑制癌細胞侵襲、轉移能力。在胃癌，CLDN4 被發現高表達于幽門螺旋桿菌相關的胃癌，長期暴露于幽門螺旋桿菌可導致CLDN4 的上調。關于CLDN4 在胃癌發生發展中的作用鮮見報道。本研究在胃癌細胞中干擾CLDN4 表達，并檢測胃癌細胞的增殖和侵襲能力。結果顯示，干擾CLDN4 表達后胃癌細胞增殖和侵襲能力下降，表明CLDN4 能促進胃癌細胞增殖、侵襲能力。

綜上所述，CLDN4 有望成為分子靶向治療的有效靶點之一。