外源水楊酸對日本落葉松幾種主要防御蛋白活力的影響

陳詠梅，彭飛飛，林健

(湖北民族大學，湖北 恩施 445000)

誘導抗性是指植物在遇到損傷、捕食、外源信號化合物等外界因素的誘導下，能影響植食者行為或降低其偏好的反應[1]，誘導抗蟲性是指植物在植食昆蟲攝取后表現出的一種抗蟲特性[2]。目前已發現多種生物和非生物因子通過誘導植物部分或整株產生有毒的次生物質、防御蛋白、驅避性物質，或改變自身營養狀態，或產生吸引天敵的揮發物等，從而使其免害或避害，達到抗蟲、防御的目的[3]。苯丙氨酸解氨酶(phenylanlanine ammonia-lyase, PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是植物體內主要防御性酶，過氧化氫酶(Catalase, CAT)、過氧化物酶(Peroxidae, POD)是植物體內主要保護性酶，它們作為植物體內關鍵的防御蛋白，與植物抗性緊密關聯[4]。馬榮金[5]等對不同黃瓜品種的抗性研究表明，植物的抗性與PAL、PPO的活性密切相關，植物細胞為應對外界脅迫而激活其PAL活性，表明酶活性與植物抗蟲能力密切相關[6]。

水楊酸( salicylic acid, SA)是植物體內常見的一種小分子酚類物質[7]，其不僅能調節植物的生長和發育，還在植物對生物脅迫和非生物脅迫的抗性中起重要作用[8]。日本落葉松(Larixkaempferi)，姿態優美，葉色翠綠，生長初期較快，木材機械性能好，是中山地帶造林的優良樹種，其引種栽培，不僅對國內木材供應、城市綠化等方面產生重大影響，而且具有較高的生態價值[9]。隨著日本落葉松在我國種植面積的不斷增大，其病蟲害防治也應加大力度，目前對日本落葉松蟲害的研究較少且缺乏系統性。鑒于此，本研究以不同濃度梯度的SA處理日本落葉松并測定針葉內主要防御蛋白活力變化，探討不同濃度水楊酸對日本落葉松誘導抗性的影響，為有效防治落葉松球蚜和誘導抗蟲性機制研究提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設計

試驗地位于恩施州建始長嶺崗林場，林場地處鄂西建始縣龍坪鄉，中心位置30°48′ N、110°03′ E，海拔1 600～1 900 m，屬北亞熱帶氣候，是國家林木良種基地，建有南方日本落葉松種子園，該縣是中國南方最大的日本落葉松基地縣[10]。2018年5月初，于試驗苗圃地選取2000株2年生日本落葉松苗，自然條件下培育待用。7月末，將水楊酸配制成3種濃度的溶液對苗木進行誘導處理，對照噴施等量溶劑，每處理組150株。詳見表1。

表1 外源水楊酸對日本落葉松的處理

處理后第1、3、5和7天進行落葉松針葉采集取樣。取樣時，在每株各方位上摘取完整的針葉，并充分混合均勻。每個處理采集16株，每4株為一個重復，重復4次，每個重復摘取30 g新鮮針葉。新鮮針葉立即進行液氮冷凍并置于冰箱冷凍保存待用。

1.2 儀器與試劑

儀器：D-37520冷凍離心機(德國)、電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)、UV-240紫外分光光度計(Biochtom Ltd. Cambridge CB4 OF J. England)、電子天平(奧豪斯國際貿易上海有限公司)、可調式移液器(上海雷勃分析儀器有限公司)。

試劑：PAL、PPO、CAT、POD試劑盒，均購自蘇州科銘生物技術有限公司。

1.3 酶活力測定方法

取適量日本落葉松針葉鮮樣進行液氮粗磨，后準確稱取日本落葉松針粗磨樣品0.1 g，低溫保存備用。酶活力測定均按照試劑盒說明書操作。

1.4 數據分析

數據分析使用SPSS24.0軟件，對試驗數據進行處理和方差分析；差異顯著性檢驗采用LSD、鄧肯法。

2 結果與分析

2.1 不同處理4種酶活性隨時間的變化趨勢

圖1不同處理4種酶活性隨時間的變化趨勢

由圖1可知，相對CK，不同濃度的SA處理后，PAL、PPO、POD活性均顯著上升，并呈現先上升后下降的波動性變化；而CAT活性在處理后呈現先下降后回升的波動性變化，但未發現其與濃度呈現明顯的依賴關系。

2.1.1 不同濃度SA對日本落葉松針葉內防御性蛋白活性的影響

圖2不同濃度SA對日本落葉松針葉內防御性酶活性的時序變化

注：上圖同一天中柱形圖上不同小寫字母表示在P=0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示在P=0.01水平上差異顯著；相同則表示差異不顯著。以下同

由圖2可知，不同濃度SA處理后的PAL、PPO活性顯著高于CK，且在不同濃度梯度之間活性差異顯著，其中SA0.1濃度下PAL活性最高、SA0.01濃度下PPO活性最高。

PAL活性，在SA0.01處理后，第1天及第3天時與CK差異極顯著，第5天時與CK差異顯著，第7天時與CK差異不顯著；SA0.1處理在各時間段均與CK差異極顯著；SA1處理僅在第1天時酶活性顯著高于SA0.01和SA1處理CK。

PPO活性，在各濃度SA處理后，第1天均與CK差異不顯著，第3天、5天、7天均與CK差異顯著；SA0.01處理酶活性在第5天、7天均顯著高于SA0.1和SA1處理。

2.1.2 不同濃度SA對日本落葉松針葉內保護性蛋白活性的影響

圖3不同濃度SA對日本落葉松針葉內保護性酶活性的時序變化

由圖3可知，CAT活性，在不同濃度SA處理后，均呈現先下降后上升的態勢，且在不同濃度梯度之間活性差異不顯著；各濃度處理在第1、7天時與CK差異不顯著，而在第3、5天時與CK表現出顯著差異。

POD活性，在SA0.01處理后，第1～7天均與CK差異極顯著；SA0.1在第5天時與CK差異極顯著，其余天數與CK差異顯著；SA1處理除第7天外，其余天數均與CK差異極顯著，且SA1處理在第1天后活性呈下降趨勢；除第1天外，SA0.01處理酶活性均顯著高于SA0.1和SA1。

3 結論與討論

誘導抗性是植物非常重要的防御措施，具有非常復雜的適應可塑性[11]。相較于植物固有的組成抗性，誘導抗性是一種更為經濟有效的防御機制[12]。PAL、PPO、CAT和POD與植物的防御抗性密切相關，常作為衡量植株抗性水平的關鍵酶，其活性改變預示著植物化學防御體系正在發生改變[13]。本研究表明，外源SA噴施后，日本落葉松內PAL、PPO、POD活性均顯著增加，其中0.1 mmol·L-1的SA溶液對PAL活性的誘導效果最佳，0.01 mmol·L-1的SA溶液對PPO和POD活性的誘導效果最佳且酶活性持續時間長；而CAT活性均呈現下降趨勢。這與劉鳳權和原永兵[14，15]研究結果一致，表明外源SA能迅速誘導日本落葉松針葉內防御物質的表達和積累，提高日本落葉松的抗蟲性。

研究外源水楊酸與植物防御之間的關系為害蟲治理和抗蟲植物培育提供了新的思路。本研究表明，SA能夠在保持植株完好的情況下，誘導植物防御蛋白的變化，其作為植物抗蟲誘導劑，具有高效、環保、可持續等特點，可實現林木害蟲綠色防治，為探索環境友善型害蟲防治技術奠定基礎。但本試驗僅作為一種基礎性的研究，為日本落葉松誘導抗性提供實踐和理論基礎，后期可進行SA溶液緩釋處理、控制酶活性的基因及處理后的針葉內揮發性物質進行進一步的研究，使外源SA誘導日本落葉松抗性增強技術能在林間綜合治理中得到有效應用。