廣西某健康雞群Ⅰ群禽腺病毒的hexon蛋白loop 1基因遺傳進化分析

張民秀，謝芝勛*，謝志勤，高約，謝麗基，劉加波，鄧顯文，羅思思，張艷芳，曾婷婷

(1.廣西壯族自治區獸醫研究所 廣西獸醫生物技術重點實驗室, 南寧 530001； 2.英國倫敦大學瑪麗女王學院, 英國倫敦 E1 4NS)

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus group Ⅰ, FAdV-Ⅰ)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，該病毒廣泛存在于雞、鴨、鵝等多種禽類的呼吸道和消化道中。根據FAdV-Ⅰ的核酸序列特征和血清交叉中和試驗結果，將FAdV-Ⅰ分為5個種群(FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D和FAdV-E)和12個血清型[1]，根據研究學者的報道，目前引起雞群心包積水-肝炎綜合征(Hydropericardium hepatitis syndrome, HHS)主要多見于FAdV-C的血清4型(FAdV-4)，而FAdV-E中的血清8b型(FAdV-8b)和FAdV-D中的血清11型(FAdV-11)主要引起雞包涵體肝炎(Avian Inclusion Body Hepatitis, IBH)[2-3]，此外FAdV-E中的FAdV-8b也可以引起肌胃糜爛癥((Adenoviral gizzard erosion, AGH)[3-4]，2006年Okuda證實FAdV-A也能導致AGH[5]。

六鄰體(Hexon)蛋白是FAdV-Ⅰ的主要結構蛋白，該蛋白呈三聚體形式，三聚體的每個hexon 分子包含兩個保守的基座區(P1和P2)和四個高變環(loop1、loop 2、loop 3 和 loop 4)，其中loop 1 基因常常被研究者用于基因分析和血清分型[6-7]。自2014年以來，中國部分地區的雞群爆發了大范圍FAdV-4的感染，造成雞群大量死亡[3,8]。本研究于2017年11月-2018年12月采集了廣西某規模化雞場不同日齡健康雞群的咽喉拭子和泄殖腔拭子4700份，從FAdV-Ⅰ陽性樣品中擴增FAdV-Ⅰ的hexon蛋白 loop 1基因序列并進行測序和序列分析，以期獲得該規模化雞場健康雞群感染FAdV-Ⅰ的情況，為進一步豐富FAdV-Ⅰ的分子流行病學和FAdV-Ⅰ病的有效控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理 2017年11月-2018年12月于廣西某規模化雞場采集不同日齡(1日齡～300日齡以上)健康蛋種雞群(品種：花雞)的咽喉拭子和泄殖腔拭子4700份(咽喉拭子和泄殖腔拭子均放置于同一個EP管，該樣品視為一份樣品)：使用2 mL PBS緩沖溶液浸泡樣品，作用2 h，反復凍融3次，3000 r/min離心10 min，取上清液并-70 ℃保存備用，每一次采樣數為雞舍內雞群飼養量的1%。

1.2 主要試劑 DH5α感受態細胞，分子克隆所需試劑盒EasyPure Genomic DNA kit和膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；TaKaRaExTaq和pMD18-T購自Takara公司；1500 bp ladder購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 引物 用于樣品檢測FAdV-Ⅰ和擴增hexon蛋白loop 1基因的引物參考文獻[9]，FAdV-1：5’-GACATGGGGTCGACCTATTTCGACAT-3’，FAdV-2：5’-AGTGATGACGGGACATCAT-3’，目的片段大小為728 bp，引物由華大基因生物科技(深圳)有限公司合成。

1.4 樣品DNA的提取 取樣品上清液200 μL按照EasyPure Genomic DNA kit的操作說明書提取咽喉拭子和泄殖腔拭子樣品中的DNA，于-70 ℃保存備用。

1.5 FAdV-Ⅰ hexon蛋白 loop 1基因的擴增及序列分析 按照EasyPure Genomic DNA kit的說明書提取 FAdV-Ⅰ 陽性樣品的DNA。參照TaKaRaExTaq操作說明進行 loop 1基因的擴增。PCR產物進行電泳純化后按照常規操作進行基因克隆，挑取陽性克隆菌液送上海立菲生物技術公司進行測序。測序所得結果在NCBI (National Center for Biotechnology Information) 上的Nucleotide Blast(Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool)工具進行鑒定，并利用LaserGene7.1和Molecular Evolutionary Genetics Analysis4.1(MEGA4.1)對hexon蛋白 loop 1 基因的核苷酸同源性進行分析，從GenBank上獲得12條FAdV-Ⅰhexon基因序列，其中血清1型(FAdV-1)(JQ647514)、血清2型(FAdV-2)(KT862806)和血清3型(FAdV-3)(KC750797)各一條，FAdV-8b(GU734104和KC750780)、血清5型(FAdV-5)(KC750798和KC750799)和FAdV-4 (KT899325和HE608152)各兩條，剩余三條為血清8a型(FAdV-8a)(KC750786、KC750801和KT862810)，本研究使用美國分類方法對 FAdV-Ⅰ的血清型進行分型，參考牛登云等[9]的研究構建hexon蛋白 loop 1基因遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 不同日齡健康雞群FAdV-Ⅰ的感染情況 采集1～35日齡雞群的咽喉拭子和泄殖腔拭子525份，40～70日齡的雞群樣品575份，71～99日齡的雞群樣品為550份，100日齡至淘汰的雞群樣品為3050份，健康雞群陽性FAdV-Ⅰ的總檢出率為8.72%。如圖1所示，40～70日齡雞群陽性FAdV-Ⅰ的檢出率為28.17%，71～99日齡、1～35日齡雞群和100日齡至淘汰的雞群FAdV-Ⅰ的檢出率分別為22.91%、0.76%和3.90%。

圖1 不同日齡健康雞群FAdV-Ⅰ的感染情況Fig 1 Infections of FAdV-Ⅰin differentages of healthy chickens

2.2 hexon蛋白loop 1基因的擴增結果和FAdV-Ⅰ種的鑒定 隨機選取FAdV-Ⅰ陽性樣品38份，擴增hexon 蛋白loop 1基因，擴增產物大小約為728 bp(圖2)。陽性克隆菌經測序并將測序結果通過NCBI 上的Nucleotide Blast工具鑒定后發現，38條hexon 蛋白loop 1基因序列包含5個種群(圖3)，其中26.32%(10/38)的序列為FAdV-A(血清1型)、2.63%(1/38)為FAdV-B(血清5型)、10.53%(4/38)為FAdV-C(血清4型)、39.47%(15/38)為FAdV-D(分別為血清2型和3型)和21.05%(8/38)為FAdV-E(分別為血清8a和8b型)。

圖2 Loop 1基因擴增結果Fig 2 The amplification result of loop 1 gene

圖3 FAdV-Ⅰ 不同種的占比情況Fig 3 The proportion of different species of FAdV-I

2.3 FAdV-Ⅰhexon蛋白loop 1基因同源性分析和遺傳進化分析 分別將不同種loop 1基因進行同源性分析，發現本研究中不同種FAdV-Ⅰloop 1基因之間同源性較低，FAdV-A的loop 1基因核苷酸序列之間的同源性為97.8%～99.6%，FAdV-C的核苷酸同源性為93.2%～98.2%；FAdV-D的核苷酸同源性為72.7%～99.8%，其中血清2型的核苷酸同源性為94.1%～99.0%，血清3型核苷酸同源性為95.9%～99.8%；FAdV-E的核苷酸同源性為81.4%～99.7%，其中血清8a型的核苷酸同源性為98.8%～99.7%，血清8b型的核苷酸同源性為94.5%～98.4%。將本研究中獲得的38條FAdV-Ⅰ loop 1基因序列進行遺傳進化分析，分析結果顯示如表1和圖4所示，本研究中的FAdV-Ⅰ 可分為5個種，分別是FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D和FAdV-E，含有7個血清型，分別是FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-8a和FAdV-8b，其中優勢種為FAdV-D，血清2型為優勢血清型，FAdV-A(血清1型)和FAdV-E(分別為血清8a和8b)次之。

3 討論與結論

FAdV-Ⅰ廣泛存在于雞群中，FAdV-Ⅰ中的FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11可以導致雞出現包涵體肝炎和心包積水-肝炎綜合征[3, 10]，近幾年來我國部分地區的雞群陸續出現以肝臟壞死和心包積液為特征的雞包涵體肝炎和心包積水-肝炎綜合征，死亡率可高達30%，對雞的養殖業造成了巨大的經濟損失[1,3,9]。目前國內關于對健康雞群感染FAdV-Ⅰ的研究較少，本研究對廣西某健康雞群FAdV-Ⅰ的感染情況進行調查，鑒別當前雞群感染FAdV-Ⅰ的血清型，這對及時應對FAdV-Ⅰ的發生和控制具有重要意義。

圖4 FAdV-Ⅰhexon蛋白loop 1基因遺傳進化樹Fig 4 The phylogenetic tree of loop 1 gene of hexon protein of FAdV-Ⅰ

表1 FAdV-Ⅰhexon蛋白loop 1基因序列信息Tab 1 The information about the loop 1 genes ofhexon protein of FAdV-Ⅰ

Yates等[11]研究表明，雞在感染腺病毒后第3周會排毒，后備母雞在感染腺病毒后第5～9周排毒量達到高峰，14周后仍有70%的陽性雞群在排毒。本研究對不同日齡蛋種雞群采集的4700份樣品的咽喉拭子和泄殖腔拭子進行FAdV-Ⅰ的檢測，發現40～70日齡和71～99日齡雞群FAdV-Ⅰ的檢出率均高于1～35日齡和100日齡以上的雞群，分別達28.17%和22.91%，FAdV-Ⅰ在40～70日齡高檢出率也說明這個階段日齡是FAdV-Ⅰ排毒高峰，這與Yates等人的研究相符。此外，本研究中71～99日齡的FAdV-Ⅰ的檢出率仍然很高，因此推測FAdV-Ⅰ的排毒高峰期可能更長，但這需要通過動物試驗進一步證實；本研究中40～99日齡雞群FAdV-Ⅰ的高感染率也再次證實了健康雞群FAdV-Ⅰ感染的普遍性。

FAdV-Ⅰ分為5個種共有12個血清型：FAdV-A(FAdV-1)、FAdV-B(FAdV-5)、FAdV-C(FAdV-4和FAdV-10)、FAdV-D(FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9和FAdV-11)、FAdV-E(FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a和FAdV-8b)[1]。王小輝等[12-13]2008年對湖南、新疆等地的活禽市場和養殖場的健康雞群的FAdV-Ⅰ進行檢測和分離，發現FAdV-Ⅰ的陽性率高達51.4%，所有分離株均屬于血清1型。羅思思等[14]于2008-2010年對從廣西活禽市場上采集的樣品進行FAdV-Ⅰ的檢測，FAdV-Ⅰ陽性率達35.5%，分離株hexon基因遺傳進化分析發現優勢血清型均為1型。本研究對獲得的38條hexon蛋白 loop 1基因進行基因分析，發現該雞場的健康雞群感染了5個種的FAdV-Ⅰ，其中39.47%的序列為FAdV-D(主要為FAdV-2和FAdV-3)并且遺傳進化分析也表明該雞場健康雞群感染的優勢種群為FAdV-D，FAdV-2為優勢血清型，FAdV-A(FAdV-1)次之，因此推測目前健康雞群感染的FAdV-Ⅰ的優勢血清型和種可能發生了變化， 隨著FAdV-D(FAdV-2)感染的病例增多，主導種群可能由FAdV-A(FAdV-1)轉變成FAdV-D(FAdV-2)，但本研究數據只展示了某個規模化雞場的數據，還需要收集更多的來源不同的FAdV-Ⅰhexon基因序列進行下一步研究。機體感染病毒的表現和結局由病毒、機體和環境相互作用所決定，其中病毒的致病性和毒力是感染結局的主要決定因素[15]。本研究在健康雞群中監測到FAdV-Ⅰ中的 FAdV-2、FAdV-4和FAdV-8b的感染。有研究表明FAdV-2和FAdV-8b型可以引起包涵體肝炎，FAdV-4可以引起心包積水-肝炎綜合征[1]，但在本研究中感染了這些血清型的雞群外表均呈現健康的狀態，并未表現出明顯的臨床癥狀，這可能是由于該健康雞群所感染的FAdV-Ⅰ的致病力和毒力較弱因而不能引起雞群發病，因此有必要下一步對病毒進行分離并通過后續的動物試驗進行證實。有研究表明禽類以自然感染或直接傳播的方式感染FAdV-Ⅰ時，均未導致機體發生疾病，但將這些FAdV-Ⅰ毒株以非腸道途徑注射感染時，機體會出現明顯的臨床癥狀，研究還發現當FAdV-Ⅰ與雞傳染性貧血和傳染性法氏囊病病毒混合感染時，某些FAdV-Ⅰ的分離株致病力會增強，直接導致機體發生肝炎或致死[1, 16-17]，這也揭示了FAdV-Ⅰ致病機制的復雜性。

本研究于2017年11月-2018年12月對廣西某規模化雞場健康蛋種雞群FAdV-Ⅰ的感染進行了分子流行病學調查，為了解健康雞群感染FAdV-Ⅰ的情況、豐富FAdV-Ⅰ的分子流行病學和FAdV-Ⅰ病的有效控制提供了參考依據。