高效液相色譜法檢測雞可食性組織中的磺胺氯吡嗪殘留

邢玉娟,呂鳳霞,陳玲,牛華星,劉運鎮,邱樹磊,馮文麗,劉聯盟,李靈娟

(1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300；2.河南牧翔動物藥業有限公司，鄭州 451162；3.山東省獸藥質量檢驗所，濟南 250022)

磺胺氯吡嗪鈉屬于磺胺類廣譜抗菌藥，在獸醫臨床主要用于球蟲病的治療，此外還可用于球蟲病暴發時繼發禽傷寒、禽霍亂的防治[1-3]，但過分濫用可導致食品中大量殘留。目前，歐美國家及我國農業農村部規定了磺胺類藥物在動物性食品中的最高殘留限量為 0.1 mg/kg[4]。近年來對動物源性食品中磺胺類藥物殘留檢測方法研究不斷深入，主要包括免疫學方法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液質聯用法、氣質聯用法等[5-8]。本試驗對聶巧等[9]建立的雞組織中磺胺氯吡嗪鈉殘留量的HPLC檢測方法進行復核驗證，以期對磺胺氯吡嗪鈉的殘留實施監控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，2489uV/Vis二極管陳列檢測器，美國Waters 公司；C18填料固相萃取小柱為美國Supelco 公司產品；PT1200組織勻漿機，瑞士KINEMATICA 公司；XH-J渦旋混合器，杭州浣熊儀器科技有限公司；N-EVAP34氮吹儀，Organomation Assciates公司；BS110S電子天平，德國賽多利斯天平公司；MXB22超聲儀，華粵行儀器有限公司。

1.1.2 試劑與材料 乙腈、甲醇為色譜純，天津市科密歐有限公司；其余試劑為分析純。磺胺氯吡嗪鈉對照品，含量99.0%，批號40908，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1日齡AA白羽肉雞，30只，購自開封正大有限公司。使用不含任何藥物的全價配合飼料飼養至30日齡，頸靜脈放血處死，無菌采集胸肌、肝臟、腎臟和皮脂組織樣品，組織勻漿后置于-20 ℃冰箱冰凍保存。

1.2 主要試液配制 0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液：準確稱取2.7218 g磷酸二氫鉀，用1000 mL超純水定容并混勻，即制得0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液；5%氨化乙腈：準確吸取氨水5 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻即得；乙腈-0.1 mol/L鹽酸水溶液：將乙腈和0.1 mol/L鹽酸水溶液按50∶50(V/V)比例混勻；乙腈飽和正己烷溶液：分別準確量取乙腈和正己烷各200 mL，充分混勻靜置，上層液體即為乙腈飽和正己烷；流動相：將乙腈和0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液按35:65(V/V)比例混勻，經0.22 μm有機濾膜過濾，超聲脫氣20 min；磺胺氯吡嗪儲備液：精密稱取磺胺氯吡嗪鈉對照品28.9 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即為濃度為1000 μg/mL的磺胺氯吡嗪標準儲備液。置-20 ℃冷凍保存；磺胺氯吡嗪標準工作液：準確吸取適量磺胺氯吡嗪標準儲備液，用流動相稀釋成適宜的磺胺氯吡嗪系列標準工作液。

1.3 色譜工作條件 流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(35:65，V/V)；色譜柱：Waters Xbridge C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長272 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL[9-11]。

1.4 標準曲線建立 準確量取適量磺胺氯吡嗪鈉儲備液，用流動相稀釋，配制成含磺胺氯吡嗪鈉質量濃度為0.08、0.20、1.00、2.00、10.00、20.00 μg/mL的標準溶液。供HPLC測定，記錄圖譜、采用外標法進行計算，以測得的峰面積A為縱坐標，相應質量濃度C為橫坐標，繪制標準工作曲線，求出回歸方程和相關系數(R2)。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品的提取 稱取2.00±0.01 g待測組織于50 mL離心管中，加入3 g無水硫酸鈉，再加入5%氨化乙腈9 mL，旋渦震蕩3 min，超聲10 min后，離心15 min(4 ℃，12000 r/min)，將上清液移至50 mL離心管中。殘渣用上述相同方法重復提取一次，合并上清液。于上清液中加入5 mL乙腈飽和正己烷，旋渦振蕩2 min，離心10 min(4 ℃，12000 r/min)，棄去正己烷，保留下層液體備用，再重復該方法除脂2次。將除脂后液體于40 ℃水浴氮氣吹至近干。用1 mL乙腈-0.1 mol/L鹽酸水溶液(50∶50，V/V)的復溶液溶解近干殘渣，旋渦振蕩1 min；再加0.1 mol/L鹽酸水溶液3 mL，旋渦振蕩1 min，離心10 min(4 ℃，12000 r/min)，取上清液備用，記為A液。殘渣加0.1 mol/L鹽酸水溶液3 mL涮洗離心管，旋渦振蕩30 s，記為B液。

1.5.2 樣品的凈化 Oasis MCX(60 mg/3 mL)小柱依次用甲醇3 mL活化，超純水3 mL平衡，將上清液A全部過柱；依次B溶液3 mL、甲醇1 mL淋洗；用5%氨化乙腈6 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL離心管中，40 ℃水浴氮氣吹干，用1 mL流動相溶解殘渣，經0.22 μm有機濾膜過濾，供HPLC測定。

1.6 方法的靈敏度考察 取空白肝臟、腎臟、皮脂和肌肉組織樣品添加適量濃度的磺胺氯吡嗪鈉標

準工作液，各5個平行，按照樣品前處理方法處理后檢測，記錄圖譜。取信噪比(S/N)≥3時的樣品濃度為檢測限(LOD)；以信噪比(S/N)≥10，且準確度與精密度符合要求的樣品濃度為定量限(LOQ)。

1.7 方法的準確度和精密度考察 采用標準添加法，進行回收率試驗。配制肌肉、肝臟、腎臟和皮脂在0.04、0.10、10.00 mg/kg三個添加濃度水平，按照樣品前處理方法處理后檢測。各濃度5個樣品平行試驗，重復3次，求添加回收率以及批內、批間的相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 色譜分離 在優化的色譜條件下，測得雞肌肉、肝臟、腎臟、皮脂中磺胺氯吡嗪鈉的保留時間分別為7.503、7.526、7.515、7.507 min，色譜峰峰形較佳，均為基線分離峰。雞肌肉、肝臟、腎臟、皮脂空白提取液在上述時間均無干擾峰出現(圖1)。

2.2 標準曲線 磺胺氯吡嗪鈉標準溶液在0.08～20.0 μg/mL濃度范圍內，藥物濃度與峰面積呈良好的線性關系，標準工作曲線Y=109.56X-74.054，R2為0.9999。

2.3 靈敏度 雞肌肉、肝臟、腎臟和皮脂組織的空白試料經前處理后檢測，測定結果表明：在相應的保留時間，空白試料對所測分析物無干擾。添加濃度為40 μg/kg時信噪比(S/N)均大于10，信噪比滿足定量限的要求，確定本方法的定量限。添加濃度為20 μg/kg時信噪比(S/N)均大于3，信噪比滿足定量限的要求，確定為本方法的定量限。

2.4 準確度、精密度 樣品添加回收率結果見表1。四種組織的回收率均在74.70%～93.67%，批內及批間變異系數均小于10%。表明該方法準確度、精密度高，重復性好。

(1為0.2 μg/mL標準溶液；2為肌肉空白樣品；3為100 μg/kg肌肉添加樣品；4為肝臟空白樣品；5為100 μg/kg肝臟添加樣品；6為腎臟空白樣品；7為100 μg/kg腎臟添加樣品；8為皮脂空白樣品；9為100 μg/kg皮脂添加樣品)圖1 雞組織中添加磺胺氯吡嗪鈉色譜圖Fig 1 The chromatograms of sulfaclozine in chicken tissues

表1 回收率試驗結果
Tab 1 Results of recovery tests

組織變異系數添加濃度/(μg·kg-1)平行5批樣品實測回收率/%12345平均回收率/%批內RSD/%批間RSD/%肌肉批內(n=5)批間(n=15)401002004010020076.6082.4783.7788.1970.1580.248.7273.6577.9086.5670.5783.3778.418.4487.5883.9391.0477.5981.6884.376.1776.6082.4783.7788.1970.1580.248.7283.5580.1082.4870.9586.5480.727.3585.3180.1686.3190.4572.7382.998.2073.6577.9086.5670.5783.3778.418.4473.4871.8866.6778.6182.8474.708.3581.1386.1475.7174.4569.4377.378.3187.5883.9391.0477.5981.6884.376.1781.3784.2375.4088.0879.7681.775.8276.7580.6881.4888.3584.6882.395.307.668.035.53肝臟批內(n=5)批間(n=15)401002004010020077.3879.1777.1982.3169.6977.156.0278.3779.5788.3478.2083.7281.645.3477.0075.9781.2780.7969.9777.005.9277.3879.1777.1982.3169.6977.156.0294.3797.5791.6191.9892.8293.672.5982.3190.7883.9979.1284.3984.125.0778.3779.5788.3478.2083.7281.645.3493.4884.8793.0394.8488.6190.964.5482.2687.1986.3583.6786.8585.262.5577.0075.9781.2780.7969.9777.005.9287.6983.3875.7379.0782.0281.585.5372.6275.2777.2781.6378.8477.124.445.926.105.68腎臟批內(n=5)批間(n=15)401002004010020089.6085.5786.6188.0487.8787.541.7488.8689.5986.8787.1287.3587.961.3685.7787.4886.7186.0685.6286.330.8989.6085.5786.6188.0487.8787.541.7484.5486.6284.7986.4288.5986.191.9081.5888.4385.4383.0884.8484.673.0688.8689.5986.8787.1287.3587.961.3689.3787.4787.6486.6089.3988.101.4185.5786.8488.0286.8089.1287.271.5585.7787.4886.7186.0685.6286.330.8987.7185.1586.6787.9285.3786.561.4888.0885.4886.4184.8886.9586.361.452.551.401.21

續表

3 討論與結論

3.1 方法學的驗證 本試驗采用 HPLC 法測定雞可食性組織中磺胺氯吡嗪鈉的藥物濃度。測定磺胺氯吡嗪鈉在雞可食性組織中的檢測限為20 μg/kg，定量限為 40 μg/kg，與聶巧等建立的磺胺氯吡嗪殘留鈉的 HPLC 檢測法研究結果一致[9]。在雞肌肉、肝臟、腎臟、皮脂各組織中添加濃度分別為40、100、200 μg/kg時，各組織樣品中磺胺氯吡嗪鈉的平均回收率范圍為74.70%～93.67%，高于聶巧等報道的75.46%～89.40%，批內和批間變異系數均小于9%，方法具有較好的回收率和精密度，證明該方法能對雞可食性組織中磺胺氯吡嗪殘留量進行有效的監控。

3.2 色譜條件的選擇 本試驗通過對磺胺氯吡嗪溶液進行紫外全波長掃描得知，在200～400 nm波長條件下，272 nm處有較大吸收，且在此條件下，組織樣品無雜質干擾峰，故選擇272 nm作為磺胺氯吡嗪的檢測波長，柱溫控制在35 ℃，磺胺氯吡嗪的檢測取得較滿意的效果。

試驗過程中比較了甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液、乙腈-0.017 mol/L磷酸水溶液、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液作為流動相，其中乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液作為流動相時基線較其他兩種流動相平穩。經過多次調整磷酸二氫鉀的濃度和兩者的比例，在比較了峰形、雜峰和藥物峰分離等情況后，最終選擇乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(35∶65)作為檢測的流動相[12]，流速1.0 mL/min，磺胺氯吡嗪保留時間在7.5 min左右，得到的峰形良好，空白組織提取液在藥物峰保留時間處無干擾峰出現。

3.3 提取方法的優化 MCX洗脫液有5%氨化乙腈、5%氨化甲醇等[13]。通過對比試驗發現5%氨化甲醇洗脫后雜峰在藥物峰附近有干擾，肝、腎組織表現尤為明顯；而5%氨化乙腈凈化效果及回收率理想。乙腈提取液可以避免從動物組織中提取過多的脂肪，而且乙腈具有良好的蛋白沉淀效果。用乙腈提取后，再用丙酮提取，磺胺氯吡嗪回收率在原有基礎上提高了13%[14]。由于磺胺氯吡嗪不溶于正己烷，所以，在提取過程結束后再經正己烷進行脫脂處理，可以脫去脂肪，從而減少雜質的干擾[15]。樣品提取過程中加入無水硫酸鈉可以促進水相和有機相分離，同時硫酸鈉的存在還可以促使蛋白質的變性分散，從而防止樣品形成團塊狀而影響提取效率，以促進溶質的析出，提高了藥物的提取率[16-17]。

在提取過程中若依靠旋轉蒸發儀濃縮提取液，易出現蒸干后吸附于瓶壁的現象，降低樣品回收率，故采用氮吹儀吹至近干[18]，再用復溶液溶解，可減少損失。提取過程結束后，利用乙腈-0.1 mol/L鹽酸溶液(50∶50)復溶液溶解殘渣。復溶液的pH值可以改變藥物的離子化程度，藥物必須完全離子化才能保證藥物完全保留于陽/陰離子交換柱上[19]。

本方法采用5%氨化乙腈提取雞組織中的磺胺氯吡嗪，正己烷除脂，40 ℃水浴氮氣吹至近干后采用復溶液(乙腈∶0.1 mol/L鹽酸水溶液50∶50，V/V)和0.1 mol/L鹽酸水溶液兩次溶解，經MCX萃取柱凈化，高效液相色譜儀檢測，驗證了雞組織中磺胺氯吡嗪殘留量的檢測方法。磺胺氯吡嗪在雞肌肉、肝臟、腎臟和皮脂中的定量限為40 μg/kg，雞空白組織磺胺氯吡嗪添加樣品在40～200 μg/kg濃度范圍內，回收率在74.70%～93.67%之間。整個實驗過程簡單、快速、回收率較高，適合雞組織中磺胺氯吡嗪殘留的定量檢測。