乳酸菌代謝γ-谷氨酰二肽及其對饅頭滋味特性的影響

閆博文，楊化宇，蔡一芥，范大明，連惠章，陳 衛，張 灝，趙建新,*

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.蘇州旅游與財經高等職業技術學校，江蘇 蘇州 215104；4.無錫華順民生食品有限公司，江蘇 無錫 214218）

饅頭作為我國傳統發酵主食擁有悠久歷史，且深受廣大消費者的喜愛[1]。隨著工業水平的不斷發展與進步，饅頭的發酵主要采用即發型活性酵母粉，其具有發酵速率快且產品批次穩定性高等優點。然而，我國山東和河南等北方地區，仍傳承著傳統酸面團發酵工藝，制得饅頭產品風味濃郁，質地更佳，始終是消費者的第一選擇[2-3]。這主要是由于酸面團發酵過程中伴隨著內源性谷物蛋白酶對大分子蛋白質聚合物的降解作用，產生大量的游離氨基酸，而酸面團中微生物可通過自身代謝將其生成具有改善產品風味的活性物質[4]。研究表明乳酸菌可代謝合成具有濃厚味（Kokumi）的滋味活性肽，此類物質可有效提高產品的滋味特性，如甜味、咸味以及酸味等，對產品感官品質有積極的作用[5-6]。

谷胱甘肽作為一種γ-谷氨酰三肽，是最早被發現具有濃厚味的活性滋味肽，其主要來源于酵母提取物和部分谷物[7]。谷胱甘肽的合成主要與酵母菌的自溶以及谷胱甘肽合成酶有關，且研究發現其對帕爾馬干酪的滋味提升有重要作用[8-9]。然而，谷胱甘肽在γ-谷氨酰轉移酶的作用下，可生成多種γ-谷氨酰二肽，其是一類具有濃厚味的滋味活性二肽，其滋味閾值在0.005～0.01 μmol/kg[5]，廣泛存在于奶酪、醬油和酸面團等發酵制品中[8,10-11]。由于其滋味閾值較低，且具有改善發酵產品滋味特性的潛在能力，因此近年來受到學者們的廣泛關注。Zhao等[10]采用羅伊氏乳桿菌發酵酸面團觀察其對γ-谷氨酰二肽合成的影響，發現乳酸菌代謝合成γ-谷氨酰二肽存在株間水平差異。然而，針對酸面團中常見的不同乳酸菌菌種對γ-谷氨酰二肽代謝合成能力的相關研究尚鮮見報道，且含有不同生成量γ-谷氨酰二肽的饅頭制品在滋味上的差異性尚不明確。因此，本研究采用分離自酸面團中的常見乳酸菌發酵，觀察比較不同乳酸菌在酸面團發酵過程中對γ-谷氨酰二肽合成量的種間水平差異，及其對產品滋味特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅伊氏乳桿菌分離自酸面團，受贈于加拿大阿爾伯塔大學；發酵乳桿菌、植物乳桿菌、食竇魏斯氏乳桿菌、舊金山乳桿菌分離自酸面團，江南大學食品學院生物技術中心保藏；即發型活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；小麥粉 加拿大Robin Hood公司；γ-谷氨酰二肽分析純標準品（γ-谷氨酰谷氨酸、γ-谷氨酰纈氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸和γ-谷氨酰亮氨酸）由美國生物公司合成制備。

1.2 儀器與設備

SM-25攪面機、SK-12P醒發箱 新麥機械（無錫）有限公司；HB24D552W電蒸箱 博西家用電器（中國）有限公司；高效液相色譜、液相色譜-二級質譜聯用儀 美國賽默飛世爾科技公司；Smart Tongue電子舌系統 上海瑞玢智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與酸面團的制備

將－80 ℃保菌管內菌液進行菌落劃線，置于厭氧培養箱內37 ℃培養18 h，挑取單菌落接種至1 mL mMRS液體培養基中，37 ℃培養16 h，活化2 代，備用。取500 μL乳酸菌發酵液接種至50 mL mMRS液體培養基中，37 ℃培養16 h，得到菌液6 000×g離心10 min，去上清液，加入等體積生理鹽水洗滌菌泥2 次，而后加入無菌水50 mL和小麥粉50 g，混勻，37 ℃培養48 h，制得酸面團備用[12]。化學酸化面團，即在面團制備過程中添加乳酸和乙酸混合溶液（體積比4∶1），調節初始面團pH 3.5。

1.3.2 酸面團pH值和微生物菌落總數的測定

采用酸面團中分離篩選得到的5 株常見乳酸菌發酵酸面團，并對其pH值和菌落總數進行比較分析。稱取10 g酸面團樣品，加入90 mL蒸餾水，攪拌20 min，靜置5 min，測定酸面團pH值；稱取10 g酸面團樣品，加入90 mL無菌生理鹽水，均質機拍打10 min，通過梯度稀釋，涂布，厭氧培養，測定酸面團中微生物菌落總數[13]。

1.3.3 酸面團中游離氨基酸總量的測定

游離氨基酸是γ-谷氨酰二肽的重要合成底物，采用不同乳酸菌發酵酸面團考察其對游離氨基酸總量的影響。稱取酸面團樣品10 g，加入5%三氯乙酸溶液50 mL，高速勻漿1 min，再以10 000 r/min離心10 min，將上清液用兩層濾紙過濾，濾液以10 000 r/min離心10 min后用鄰苯二醛進行柱前衍生，然后高效液相色譜進樣進行游離氨基酸分析，每個樣品至少重復2 次操作[14]。

色譜條件：采用ODS Hypersil毛細管色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為20 mmol/L乙酸鈉的甲醇-乙腈溶液（體積比1∶2），設置流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，紫外檢測器波長338 nm。

1.3.4 面團模擬體系和酸面團中γ-谷氨酰二肽含量的測定

采用面團模擬體系對乳酸菌發酵合成γ-谷氨酰二肽進行初步的驗證。面團模擬體系參考Zhao等[10]的方法：將活化后的乳酸菌菌液接種至緩沖鹽溶液中，37 ℃培養24 h。其中緩沖鹽溶液中含有5 g/L麥芽糖和10 g/L氨基酸混合溶液（谷氨酰、胺谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸）。為驗證乳酸菌菌種是否可自身轉化生成γ-谷氨酰二肽，將活化后的乳酸菌菌液接種至無氨基酸底物的緩沖鹽溶液中進行分析比較。分別取0 h和發酵24 h后的模擬緩沖溶液，離心，過濾，濾液用于液相色譜-二級質譜分析γ-谷氨酰二肽的含量。

采用C18高效液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm），流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液，洗脫速率0.2 mL/min，設置程序：0～10 min，95%～75% A；10～15 min，75%～0% A；15～25 min，0%～95% A；平衡10 min。采用多重反應監測的方法對γ-谷氨酰二肽進行檢測分析，4 種目標物質離子對參數見表1。將標準品溶于甲醇-水-甲酸溶液（30∶69.9∶0.1，V/V）中，用于標準曲線的繪制與計算。其中，標準品質量濃度為0.1～100 μg/L。

表1 γ-谷氨酰二肽在液相色譜-二級質譜中測定參數Table 1 LC-MS/MS parameters for detection of γ-GPs

1.3.5 酸面團發酵饅頭樣品的制備

制備500 g面團，酸面團發酵組和空白對照組配方見表2。將配料置于攪面機中先慢速攪拌4 min，再快速攪拌3.5 min，將成型面團取出，切分成80 g/個，手工搓圓，置于醒發箱內，35 ℃、相對濕度85%條件下發酵50 min。醒發結束后，將面團置于電蒸箱內，100 ℃加熱20 min，室溫冷卻，備用。

表2 饅頭制作配方Table 2 Steamed bread recipes

1.3.6 基于電子舌對酸面團發酵饅頭滋味特性的測定

根據何曉赟[15]的方法，并適當修改：稱取不同乳酸菌發酵酸面團制得的饅頭100 g，粉碎，并加入300 mL去離子水，高速勻漿1 min后，置于離心機中3 000×g離心10 min，取上清液。量取上清液100 mL，數據采集中以清洗液（蒸餾水）和待測樣品萃取液交替進行，為使傳感器響應值趨于平穩，每個樣品采集時間為120 s，每隔1 s采集一個數據，采集完畢清洗20 s。為減少測量誤差，本試驗取最后10 s測量值的平均值作為各傳感器的后續處理數據。

1.4 數據處理

研究數據處理均采用Origin 8.0軟件分析作圖，SAS 8.0進行統計學數據分析，采用ANOVA方法進行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。結果均為3 次實驗平均值。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌發酵酸面團的理化特性

由表3可知，不同乳酸菌發酵酸面團48 h后pH值均可達到3.50左右，菌落總數可達到108CFU/g以上。酸面團pH值的降低主要是由于乳酸菌生長代謝產生的乳酸等有機酸成分積累造成[16]。然而，過多的H＋和有機酸組分對菌株的生成代謝有強烈的抑制作用[17]。因此，不同乳酸菌在長時間酸面團發酵過程中，pH值和菌落總數在菌種間并無顯著性差異。

表3 不同乳酸菌發酵對酸面團pH值和菌落總數的影響Table 3 Effect of various lactobacilli on pH and total bacterial count of sourdough

2.2 乳酸菌發酵酸面團對游離氨基酸總量的影響

圖1 不同乳酸菌發酵酸面團的游離氨基酸總量Fig. 1 Effect of various lactobacilli on the total content of free amino acids in sourdough

如圖1所示，與化學酸化相較，乳酸菌發酵可顯著提高面團中游離氨基酸總量。在酸面團發酵過程中，由于谷物中的氮源主要以無機形式存在，乳酸菌自身蛋白水解系統無法利用，對此類氮源的降解能力較為有限[18]。其主要是通過乳酸菌代謝產酸創造的低酸環境激活谷物中的內源性蛋白酶，進而促進小麥粉中大分子蛋白聚合物的降解，產生大量的游離氨基酸[19]。乳酸菌發酵酸面團是一個緩釋酸化的過程，谷物蛋白酶最適pH 4.0，而化學酸化面團pH值始終保持在3.5左右，因此面團中游離氨基酸總量顯著低于乳酸菌發酵組[20]。此外，結果還表明不同乳酸菌發酵酸面團中游離氨基酸總量存在顯著差異，這主要是由于乳酸菌對面團中小分子蛋白，如清蛋白、球蛋白和谷蛋白等，具有良好的水解能力[21]。根據本實驗結果可推測乳酸菌對小分子蛋白質的水解能力存在種間差異性，進而導致面團中游離氨基酸總量存在顯著差異性，這也為γ-谷氨酰二肽的生成提供了物質基礎。

2.3 酸面團模式體系下乳酸菌對γ-谷氨酰二肽合成的影響

基于酸面團中游離氨基酸單體含量的比較，本研究選擇將γ-谷氨酰谷氨酸、γ-谷氨酰纈氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸和γ-谷氨酰亮氨酸作為γ-谷氨酰二肽代表性目標產物，用于闡明乳酸菌對γ-谷氨酰二肽合成的影響。首先，乳酸菌接種在無游離氨基酸模擬溶液中，γ-谷氨酰二肽并未檢出，由此說明乳酸菌在無外源底物的情況下，通過自身代謝無法生成γ-谷氨酰二肽。而由圖2可知，不同乳酸菌對γ-谷氨酰二肽的合成存在種間差異性，其中羅伊氏乳桿菌發酵合成γ-谷氨酰二肽含量最高。根據γ-谷氨酰二肽單體合成量的比較可以發現，不同乳酸菌發酵液中γ-谷氨酰谷氨酸和γ-谷氨酰異亮氨酸合成量顯著高于γ-谷氨酰亮氨酸和γ-谷氨酰纈氨酸。Zhao等[10]在比較同種不同株水平上羅伊氏乳桿菌對γ-谷氨酰二肽代謝合成的影響中也得到了類似的結果。由此可推測乳酸菌在利用游離氨基酸合成γ-谷氨酰二肽時存在選擇性的差異，其通過自身代謝酶系優先選擇谷氨酸和異亮氨酸用于相應γ-谷氨酰二肽的合成。針對乳酸菌合成γ-谷氨酰二肽的形成過程，現有研究認為主要與γ-谷氨酰轉移酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以及谷胱甘肽合成酶有關[22-23]。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶均與谷胱甘肽的合成有關，而谷胱甘肽可通過γ-谷氨酰轉移酶生成不同的γ-谷氨酰二肽類物質[24]。基于NCBI數據庫，將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調控基因序列與不同種乳酸菌的基因序列進行比對發現，除舊金山乳桿菌以外，本實驗所用乳酸菌均含有1～3 個γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調控基因[25]。然而，Kai等[26]的報道顯示舊金山乳桿菌中含有谷胱甘肽合成酶，這可能與其代謝合成γ-谷氨酰二肽有重要的關系。

圖2 不同乳酸菌發酵對酸面團模擬體系中γ-谷氨酰二肽含量的影響Fig. 2 Effect of various Lactobacillus strains on the concentration of γ-glutamyl dipeptides in buffer-based model dough

2.4 乳酸菌發酵對酸面團中γ-谷氨酰二肽含量的影響

為進一步驗證乳酸菌發酵面團對γ-谷氨酰二肽合成的影響，采用不同種乳酸菌發酵酸面團比較發酵過程中γ-谷氨酰二肽的合成量。由表4所示，發酵初始階段，面團中可測得少量的γ-谷氨酰谷氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸和γ-谷氨酰亮氨酸，而γ-谷氨酰纈氨酸并未檢出，這可能與小麥粉中谷氨酸含量較高有關[27]。酸面團經過48 h發酵后（表5），4 種γ-谷氨酰二肽均增加，且γ-谷氨酰谷氨酸和γ-谷氨酰異亮氨酸合成量增加更為顯著，這一結果與面團模擬發酵液所得到的結果一致。由γ-谷氨酰二肽總量可知，羅伊氏乳桿菌具有更優的γ-谷氨酰二肽合成能力，再次驗證了乳酸菌在酸面團發酵過程中對于γ-谷氨酰二肽的合成存在種間差異性。此外，采用額外添加蛋白酶的方式，通過提高面團體系中游離氨基酸總量，觀察4 種γ-谷氨酰二肽含量的變化（數據未列出）。結果表明，游離氨基酸底物濃度的增加可有效促進4 種γ-谷氨酰二肽的合成量，由此說明γ-谷氨酰二肽的合成與發酵過程中蛋白質水解程度有緊密的關系。

表4 不同乳酸菌發酵0 h對酸面團中γ-谷氨酰二肽濃度的影響Table 4 Effect of various Lactobacillus strains on the concentration of γ-glutamyl dipeptides in unfermented sourdough μmol/L

表5 不同乳酸菌發酵48 h對酸面團中γ-谷氨酰二肽濃度的影響Table 5 Effect of various Lactobacillus strains on the concentration of γ-glutamyl dipeptides in 48 h fermented sourdough μmol/L

2.5 乳酸菌發酵酸面團制備饅頭樣品的電子舌滋味分析

研究表明，具有濃厚味的活性物質可有效提高產品的其他滋味強度，如酸味、鮮味和咸味等，進而顯著改善提升產品的滋味特性。為進一步驗證乳酸菌發酵酸面團代謝合成γ-谷氨酰二肽對饅頭滋味特性的影響，研究采用電子舌對不同乳酸菌發酵酸面團制得饅頭的滋味特性進行分析比較，由圖3可知，與空白對照組相較，乳酸菌發酵酸面團制得饅頭在酸味、鮮味和咸味上存在顯著差異。乳酸菌發酵可代謝積累乳酸等有機酸成分，因此制得產品相較空白組酸味顯著增強。其中，由于植物乳桿菌生長速率快，產酸能力較強，因此其制得產品酸味值較高[28]。針對咸味方面，由于產品配方中并未添加任何咸味成分，其咸味可能與發酵過程中代謝形成的咸味氨基酸或小分子肽有關[29-30]。然而，通過與空白組比較，結合不同乳酸菌發酵酸面團對γ-谷氨酰二肽合成量的分析發現，羅伊氏乳桿菌發酵過程中γ-谷氨酰二肽合成量最高，其制得產品咸味值也是最強的。由此推斷，γ-谷氨酰二肽與饅頭咸味的增強有一定的聯系。隨著消費者對低鈉攝入健康飲食的不斷推崇，這為乳酸菌發酵高產γ-谷氨酰二肽制備低鈉發酵食品奠定了理論基礎，也為米面發酵食品優質菌種的篩選提供了理論依據。

圖3 不同乳酸菌發酵酸面團制得饅頭滋味特性的比較Fig. 3 Effect of sourdough fermented by various Lactobacillus strains on the taste of steamed bread

3 結 論

研究表明，不同乳酸菌發酵酸面團均可通過自身代謝合成γ-谷氨酰二肽，但在發酵過程中對合成底物具有優先選擇性，且其代謝合成量種間存在顯著差異。在酸面團常見發酵菌種中，羅伊氏乳桿菌合成γ-谷氨酰二肽能力最優。此外，舊金山乳桿菌雖然不含γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，但仍可代謝合成γ-谷氨酰二肽，說明γ-谷氨酰二肽的代謝調控可能與γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶有關。電子舌分析數據表明，γ-谷氨酰二肽可顯著提升產品的咸味強度，有效提升產品的滋味特性，這也為酸面團發酵制得饅頭產品風味濃郁提供了新的理論佐證。