阿托伐他汀對早期慢性腎臟病頸動脈斑塊患者周圍淋巴細胞GSK-3的作用

孫寅軼　張清德　李松華　曲忠森

[摘要] 目的 探討阿托伐他汀對早期慢性腎臟病（CKD）頸動脈斑塊患者周圍血淋巴細胞糖原合酶激酶-3（GSK-3）的作用。 方法 選擇2017年1～10月在上海健康醫學院附屬第六人民醫院東院和山東省菏澤市立醫院就診的CKD 1～2期并頸動脈斑塊患者143例，按照隨機數字表法將其分為CKD組（76例）和治療組（67例）。同時選擇同期年齡在42歲以上的正常人50名為對照組。治療組口服阿托伐他汀20 mg/晚，治療6個月后觀察不同時間點患者外周血淋巴細胞GSK-3β活性及GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平變化。采用放射性配體結合試驗檢測GSK-3β的活性，蛋白質印跡法檢測GSK-3β Ser9位點的磷酸化及總GSK-3β水平。 結果 治療前，與對照組比較，CKD組頸動脈內膜中層厚度（IMT）明顯增厚（P < 0.01），外周血淋巴細胞GSK-3β的活性明顯降低（P < 0.01），且外周血淋巴細胞GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平明顯升高（P < 0.01）。與CKD組比較，治療組使用阿托伐他汀治療6個月可使IMT縮小（P < 0.05），促進GSK-3β的活性明顯恢復（P < 0.01），且能降低外周血淋巴細胞GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平（P < 0.01）。 結論 本研究提示CKD患者外周淋巴細胞GSK-3活性降低可能與促進頸動脈粥樣硬化及斑塊形成有關，并進一步提示阿托伐他汀可能通過降低GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平，升高GSK-3活性，從而進一步抑制頸動脈硬化及斑塊的形成。

[關鍵詞] 阿托伐他汀;早期慢性腎臟病;頸動脈斑塊;淋巴細胞;糖原合酶激酶-3

[中圖分類號] R741? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（a）-0138-06

Effects of Atorvastatin on glycogen synthase kinase-3 in lymphocytes of carotid atherosclerotic plaques in patients with early chronic kidney disease

SUN Yinyi1? ?ZHANG Qingde2? ?LI Songhua3? ?QU Zhongsen4

1.Department of Neurology， East Branch of Shanghai Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai University of Medicine & Health Sciences， Shanghai? ?201306， China; 2.Department of Physician， Heze Medical College， Shandong Province， Heze? ?274000， China; 3.Department of Radiology， East Branch of Shanghai Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai University of Medicine & Health Sciences， Shanghai? ?201306， China; 4.Department of Rehabilitation， East Branch of Shanghai Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai University of Medicine & Health Sciences， Shanghai? ?201306， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Atorvastatin on glycogen synthase kinase-3 （GSK-3） in lymphocytes of carotid plaques in patients with early chronic kidney disease （CKD）. Methods One hundred and forty-three patients with CKD 1-2 and carotid plaque from January to October 2017 in East Branch of Shanghai Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai University of Medicine & Health Sciences and Heze Municipal Hospital were enrolled and divided into CKD group （76 cases） and treatment group （67 cases） according to random number table method. At the same time， 50 normal people over the age of 42 years were selected as the control group. The treatment group received oral Atorvastatin 20 mg/night. After 6 months of treatment， the activity and expression changes of GSK-3β and GSK-3β at Ser9 in peripheral blood lymphocytes of patients at different time points were observed. The GSK-3 activity was measured by 32P liquid scintillography for incorporated radioactivity， and the phosphorylation of GSK-3β at Ser9 and the total GSK-3β were determined by Western blot. Results Before treatment， compared with the control group， the carotid intima-media thickness （IMT） was significantly thicker （P < 0.01）， and the activity of GSK-3β was significantly decreased （P < 0.01）， and the phosphorylation of GSK-3β at Ser9 was significantly increased in lymphocytes in CKD group （P < 0.01）. When the treatment group treated with Atorvastatin for 6 months， the thickened IMT was reversed （P < 0.05）， and the activity of GSK-3 was resumed （P < 0.01）， and the phosphorylation of GSK-3β at Ser9 was decreased as compared with CKD group（P < 0.01）. Conclusion Lower activities of GSK-3 in lymphocytes of patients with early CKD might be associated with the formation and promotion of carotid atherosclerosis plaque. Atorvastatin might inhibit carotid atherosclerotic plaques by increasing activity of GSK-3 in phosphorylation of GSK-3β at Ser9.

[Key words] Atorvastatin; Early chronic kidney disease; Carotid plaque; Lymphocyte; Glycogen synthase kinase-3

頸動脈斑塊與腦血管病發病密切相關[1-2]。慢性腎臟病（CKD）患者的頸動脈血管內膜-中膜厚度增加[3]，表明慢性腎功能不全患者有頸動脈斑塊的形成[4-5]。多項研究表明糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）通過多種途徑在動脈粥樣硬化的發展中起作用[6-7]。他汀類藥物能夠通過PI3K/Akt/GSK-3β和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑起到穩定斑塊的作用，從而預防細胞缺血性損傷[8-10]。本研究檢測了早期CKD并頸動脈斑塊患者的外周血淋巴細胞中GSK-3，并觀察阿托伐他汀治療前后血淋巴細胞GSK-3的變化，探討其在早期CKD并頸動脈斑塊患者的潛在治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究收集了2017年1～10月在上海健康醫院附屬第六人民醫院東院和山東省菏澤市立醫院腎臟科就診的CKD 1～2期并頸動脈斑塊患者143例，所有患者均需符合“慢性腎臟病的評估和管理”（2012版KDIGO指南）制訂的CKD診斷標準[11]，經醫院醫學倫理委員會批準，以及患者本人或家屬同意，采用隨機數字表法將患者分為CKD組（76例）和治療組（67例）。

排除標準：合并除缺血性腦卒中以外的其他顱內疾患;合并腫瘤、血液系統疾病、風濕性心臟病及房顫;1個月內手術及外傷史;自身免疫性疾病;服用抗自由基藥物史。

選擇同期年齡在42歲以上的正常人50名為對照組，對照組未做任何處理，只檢測相應數值作為對照。三組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 治療方法? 所有患者進行控制血糖、控制血壓、腎保護治療，治療組在常規治療的基礎上每晚20 mg阿托伐他汀（立普妥，輝瑞制藥有限公司，H20051408， 20 mg）口服，兩組均以6個月為1個療程。

1.2.2 頸動脈內膜中層厚度（IMT）的測定? 應用彩色多普勒超聲診斷儀PHILIPS-IU22，線陣探頭，頻率7.0 MHz，測量IMT值[12]。

1.2.3 樣本采集? 對照組、CKD組和治療組均于采血前空腹12 h，用肝素抗凝管采集靜脈血10 mL，用磷酸鹽緩沖液（PBS）等量稀釋，將6 mL稀釋的血細胞液加入離心管，室溫下800 g離心20 min，取淋巴細胞用PBS稀釋，800 g離心20 min，沖洗3次，再稀釋成（4～10）×106個/mL的懸液。加入100 μL細胞裂解液，經超聲破碎（10 s，3次）后，12 000 g離心20 min，采用二喹啉甲酸蛋白測定法測定蛋白質濃度，-80℃冰箱保存。

1.2.4 GSK-3的活性測定? 按照Pei等[13]的方法進行。將7.5 μg蛋白加入總量為25 μL，含有pH 7.4的30 mmol Tris、10 mmol MgCl2、10 mmol NaF、1 mmol Na3VO4、2 mmol EGTA、10 mmol β-ME、200 μmol [γ-32P] ATP（1500 cpm/pmol ATP），以及20 μmol phospho-GS底物的緩沖液中，30℃孵育30 min，用25 μL 300 mmol H3PO4反應液終止反應。各反應體系分別取25 μL滴在磷酸纖維膜上，以75 mmol H3PO4定時沖洗抽濾，濾膜曬干并置入液閃瓶中，加二甲苯閃爍液，隔夜以液體閃爍儀計數。酶活性用各樣本與對照比較所得相對活性表示。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平? 按照Liu等[14]的方法進行。取上清液，加入1/3體積4×上樣緩沖液（終濃度為0.1 mol/L Tris，pH 6.8，4% SDS，20%甘油），沸水中變性10 min，冷卻后備用。用10%聚丙烯酰胺分離膠，將蛋白質提取物分離，轉印到硝酸纖維膜上。用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h。5%脫脂牛奶稀釋的特異性識別GSK-3β Ser9位點的抗體（1∶1000稀釋，Cell Signaling Technology，#9336）37℃孵育2 h，0.05 mol/L TBS緩沖液（pH 7.5）漂洗，再用5%脫脂牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶30 000稀釋）37℃孵育1 h，0.05 mol/L TBS緩沖液漂洗，ECL顯色10 min。采用Kodak圖象分析系統及Image-Proplus軟件分析結果。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件包進行數據分析，計數資料以例數表示，采用χ2檢驗;計量資料以均數±標準差（x±s）表示，經正態性檢驗符合正態分布，對重復測量數據之間是否存在相關性進行球形檢驗，若檢驗結果為P > 0.05，采用單因素方差分析;若檢驗結果為P < 0.05，采用重復測量方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD-t）分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組患者臨床基本情況比較

在觀察開始時CKD組及治療組空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油水平和收縮壓均高于對照組（P < 0.05），IMT、舒張壓和血清肌酐也明顯高于對照組（P < 0.01）。但CKD組與治療組以上各指標比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 三組治療后血脂及IMT的比較

治療6個月后，CKD組的總膽固醇、三酰甘油、IMT仍高于對照組（P < 0.05或P < 0.01）;與CKD組比較，治療組總膽固醇、三酰甘油水平明顯降低（P < 0.05或P < 0.01），并且IMT明顯縮小（P < 0.05）。治療組與對照組各指標比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

2.3 阿托伐他汀對早期CKD患者外周血淋巴細胞GSK-3β活性的影響

治療前，CKD組及治療組外周血淋巴細胞GSK-3β的活性均低于對照組（P < 0.05）。治療3個月時，CKD組外周血淋巴細胞GSK-3β的活性較治療前降低（P < 0.05），并逐漸明顯降低至治療6個月（P < 0.01），且均低于同時點對照組（P < 0.01）。治療組在治療1個月時GSK-3β的活性較對照組仍低（P < 0.05），在2個月至6個月，GSK-3β活性較治療前有升高（P < 0.05），并與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），較CKD組明顯升高持續到6個月（P < 0.01）。見表4。

2.4 阿托伐他汀對早期CKD患者外周血淋巴細胞GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平及總GSK-3β的表達的影響

治療前，CKD組及治療組外周血淋巴細胞GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平均高于對照組（P < 0.01）。CKD組外周血淋巴細胞GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平在3～6個月較治療前均有升高（P < 0.05），在1～6個月較對照組明顯升高（P < 0.01）。治療組GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平在2個月時較治療前有降低（P < 0.05），隨后3～6個月明顯降低（P < 0.01），在2～6個月較CKD組明顯降低（P < 0.01），但是在治療前3個月較對照組仍有明顯增高（P < 0.05或P < 0.01）;在6個月與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。各時點各組外周血淋巴細胞總GSK-3β的表達水平比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表5～6及圖1。

3 討論

CKD患者并發腦梗死的比例明顯增加[15]，原因在于其不僅增加動脈硬化常見的如高血壓、糖尿病、高血脂等危險因素，而且引起高同型半胱氨酸血癥、貧血、低蛋白血癥、氧化應激及炎性反應等，進而影響血管重塑[3，16]。本研究結果顯示，CKD組和治療組空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、收縮壓水平高于對照組（P < 0.05），并且IMT和舒張壓也明顯高于對照組（P < 0.01），提示脂質代謝紊亂、高血糖以及高血壓仍是早期CKD患者并發頸動脈斑塊的危險因素。口服阿托伐他汀6個月，能夠降低治療組血脂水平（P < 0.05或P < 0.01），并且明顯縮小IMT（P < 0.05），提示阿托伐他汀能夠縮小早期CKD患者IMT，降低血脂水平。

在大鼠頸動脈平滑肌細胞泡沫損傷試驗中，GSK-3β的磷酸化水平升高且活性被抑制[17-18]。研究表明，血管內皮功能損傷會激活PI3K-Akt途徑，降低GSK-3活性，減少凋亡及促進平滑肌細胞增殖，促進血管重構[10，17]，GSK-3β信號通路與動脈硬化的病理生理相關，且與腦缺血導致的神經元變性相關[19-20]。CKD組治療3個月至6個月時外周血淋巴細胞GSK-3β的活性較對照組明顯降低（P < 0.01），GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平較對照組明顯升高（P < 0.01），提示CKD患者外周血淋巴細胞GSK-3β活性降低并隨病情進展持續降低，GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平持續升高是導致其活性降低的可能原因。本研究結果顯示，各組總GSK-3β的表達比較，差異無統計學意義（P > 0.05），提示總GSK-3β無明顯改變。GSK-3活性降低可能會促進頸動脈粥樣硬化及頸動脈斑塊形成。

治療組在2個月后GSK-3β活性較治療前有升高（P < 0.05），與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），較CKD組明顯升高（P < 0.01）。此結果提示阿托伐他汀能夠在早期升高CKD患者外周血淋巴細胞GSK-3β的活性，通過恢復GSK-3β的活性，降低斑塊形成。并且，治療組2個月后GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平較治療前降低（P < 0.05），且較CKD組明顯降低（P < 0.01），在6個月與對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。此結果提示阿托伐他汀能夠降低早期CKD患者外周血淋巴細胞GSK-3β Ser9位點的磷酸化水平，可能進一步促進平滑肌細胞凋亡，減少平滑肌細胞增殖，減輕及逆轉頸動脈粥樣硬化及頸動脈斑塊形成。

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（收稿日期：2018-12-27? 本文編輯：張瑜杰）