食管癌120例microRNA-24表達與放療敏感性的相關性分析

朱 勇，候 婧，魯正學，吳 蘭，李 燦

食管癌是消化道上皮組織源性惡性腫瘤，早期缺乏特異性癥狀，多數確診已處于中晚期，癥狀以進行性吞咽困難為主。食管癌預后差，其5年生存率僅為30%[1]。放射療法是食管癌的重要治療手段，有研究表明不同患者對放療的抵抗性不同，療效存在顯著差異[2]。尋找敏感、特異的分子標志物對食管癌放療效果進行預測對制定個體化方案有重要臨床意義。已有報道指出microRNA(miRNA)可作為癌基因或抑癌基因，與腫瘤進程有明顯關聯[3]。筆者對120例食管癌患者放療敏感性及相關性進行分析對比，旨在為臨床治療提供借鑒。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017-05至2018-08我院放療科收治的120例食管癌患者，均為中晚期腫瘤患者，其中男75例，女45例，年齡60～78歲，平均(68.2±6.4)歲；鱗癌108例，腺癌12例，排除肝腎功能異常、免疫缺陷和其他惡性腫瘤等，均自愿接受放射治療，并同意本次研究。

1.2 放療方法 放射治療采用三維適形放療，模擬CT下勾畫靶區，臨床靶體積外0.5 cm為計劃靶體積，采用6MV-X照射治療，總劑量為60～70 Gy,1次/d，5d/周，連續治療6～7周。放射過程中出現放射性食管炎給予對癥治療。

1.3 檢測方法 放療前收集上述患者血清作為標本。空腹抽取外周靜脈血5 ml入不加抗凝劑的采血管中，標本室溫靜置30 min后，于2 h內以2000 r/min離心10 min，將2 ml血清移至EP管中，編號密封于-80 ℃冰箱中保存為后續PCR實驗準備。

1.3.1 試劑和儀器 主要試劑：Trizol(美國Invitrogen)；All-in-OneTMmi RNA q RT-PCR Detection kit(美國 Gene Copoeia 公司)；DEPC 水(上海生工)；氯仿(中國國藥集團)；異丙醇(中國國藥集團)；無水乙醇(中國國藥集團)等。主要儀器：實時熒光 PCR 儀 CFX96(美國 Bio-Rad 公司)；高速低溫離心機(德國 Eppendorf 公司)；移液器(德國 Eppendorf 公司)；干浴恒溫器(其林貝爾)；-80 ℃冰箱(美國Thermo)。

1.3.2 PCR實驗步驟 trizol法提取血清總RNA；實時熒光定量PCR兩步法反應體系，設計miR-24引物，然后使用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA，配制實時熒光定量PCR反應體系，設置反應程序(95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s)，利用PCR儀自帶軟件進行分析，獲得并計算血清miR-24的Ct值。

1.4 療效標準 采用實體瘤療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors ,RECIST)進行評價。(1)完全緩解：所有病灶消失；(2)部分緩解：基線病灶長徑總和縮小≥30%；(3)穩定：基線病灶長徑綜合縮小<30%，或增加<20%；(4)進展：基線病灶長徑總和≥20%，或出現新病灶。將穩定和進展的患者視為放療抵抗組，將完全緩解和部分緩解視為放療敏感組。

1.6 結果

1.6.1 放療敏感性分組結果 依據實體瘤療效評價標準分組，120例中放療敏感組68例(完全緩解6例，部分緩解62例)，占56.67%，放療抵抗組52例(25例穩定，27例進展)，占43.33%。

1.6.2 兩組miR-24水平比較 實時熒光定量檢測結果提示：放療抵抗組放療前血清miR-24的Ct值高于放療敏感組，差異具有統計學意義(P<0.05)；放療后放療抵抗組血清miR-24的Ct值明顯高于放療敏感組，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 兩組食管癌患者放療前后的血清miR-24的Ct值比較

2 討 論

放療是通過電離輻射產生自由基從而對癌細胞進行殺傷的一種治療方法，國內外研究認為miRNA參與到了癌細胞細胞損傷當中，可能作為放療的生物標志物[4,5]。miRNA表達水平可能同腫瘤細胞的輻射劑量、輻照時間等有關，然后作用到靶基因，對下游蛋白進行調節。有研究對食管癌患者進行基因芯片分析，發現microRNA-296、microRNA-145、microRNA-17、microRNA-24等微小RNA均參與到DNA損傷修復中[6]。在腫瘤細胞中，通過miRNA水平改變調控細胞周期。

miRNA成為預測食管癌放療化療療效和預后判斷的標志物，也可能成為治療靶點[7-9]。Ct值是反映基因拷貝數的指標，Ct值越高，基因拷貝數越低[10]，本文對我院放療科收治的120例食管癌患者的血清miRNA進行分析發現，放療抵抗組放療前后血清miR-24的Ct值均明顯高于放療敏感組，說明放療抵抗組中的miR-24表達量較少，反之miR-24表達量越多的患者，對放射治療的敏感性可能就越好，治療效果可能就更佳。與文獻[11]研究發現miR-24通過作用于SP1能夠增強鼻咽癌的放療敏感性，結果基本一致。但食管癌患者存在放療差異性，具有不同程度的不良反應，因此在放療前通過檢測miR-24的表達預測放療療效，有助于食管癌放療的個體化治療。

總之，miR-24的低表達可能與食管癌放療抵抗有關，下一步我們將繼續研究miR-24調節H2AX的信號通路機制，為miR-24預測食管癌放療效果并制定個體化方案提供證據。