ZBP-89與缺氧信號因子HIF-1α在肝癌細胞中的相關性研究

李闖 葉勁松 劉昕

摘要：目的? 探討ZBP-89在肝癌組織中的表達與缺氧誘導因子HIF-1α的相關性，為證實ZBP-89通過抑制HIF-1α/Notch1信號通路降低肝癌干細胞“干性”提供依據。方法? 選擇2016年8月～2018年8月深圳市龍華區人民醫院與深圳市人民醫院肝膽胰外科120例原發性肝癌患者作為研究對象，收集病理標本，采用免疫組化染色方法來檢測肝癌細胞及癌旁組織中ZBP-89、HIF-1α的相關表達，分析二者之間的相關性。結果? ZBP-89在肝癌組織中呈現出低表達狀態，而在癌旁組織中卻呈現出高表達狀態，分別為34.17%、62.50%;ZBP-89在癌旁組織中表達高于肝癌組織（P<0.05）。而在肝癌組織細胞中發現ZBP-89的表達與缺氧信號因子HIF-1α的表達呈負相關（P<0.05）。結論? ZBP-89很可能為肝癌發生、發展過程中一個潛在的抑癌基因，通過抑制HIF-1α/Notch1通路進而抑制肝癌干細胞增殖、增強肝癌干細胞對化療藥物的敏感性，可能是其發揮抑癌效應的重要機制。

關鍵詞：肝癌;ZBP-89;HIF-1α;缺氧調控因子

中圖分類號：R735.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.023

文章編號：1006-1959（2019）15-0074-03

Abstract：Objective? To investigate the correlation between the expression of ZBP-89 in hepatocarcinoma and the hypoxia-inducible factor HIF-1α， and to provide evidence for ZBP-89 to reduce the "dryness" of liver cancer stem cells by inhibiting HIF-1α/Notch1 signaling pathway.Methods? From August 2016 to August 2018， 120 patients with primary liver cancer in the Department of Hepatobiliary Surgery of Shenzhen Longhua District People's Hospital and Shenzhen People's Hospital were selected as subjects. Pathological specimens were collected and immunohistochemical staining was used to detect liver cancer cells. The correlation expressions of ZBP-89 and HIF-1α in adjacent tissues were analyzed， and the correlation between them was analyzed. Results? ZBP-89 showed low expression status in liver cancer tissues， but high expression status （41/120， 75/120） in adjacent tissues 34.17%， 62.50%， respectively; ZBP-89 in adjacent tissues the expression was higher than that of liver cancer tissues （P<0.05）. The expression of ZBP-89 was negatively correlated with the expression of hypoxia signal factor HIF-1α in hepatocarcinoma cells （P<0.05）.Conclusion? ZBP-89 is likely to be a potential tumor suppressor gene in the development and progression of hepatocarcinoma. It can inhibit the proliferation of hepatocellular carcinoma stem cells and enhance the sensitivity of liver cancer stem cells to chemotherapeutic drugs by inhibiting HIF-1α/Notch1 pathway. An important mechanism of effect.

Key words：Liver cancer;ZBP-89;HIF-1α;Hypoxia regulator

ZBP-89（zinc-finger binding protein-89）是1996年由Merchant等首先發現，是Krüppel-type（Cys2-His2-type）鋅指蛋白家族成員之一。因其N端含有四個鋅指結構域和分子量大小為89 kD，所以命名為ZBP-89[1]。ZBP-89是一個具有雙向調節功能的轉錄因子，通過結合富含GC的DNA序列激活或抑制基因表達[2]。目前發現受其上調的靶基因有p21、Bak、MMP3、pdcd4、IAP、stromelysin、GHR等，受其下調的靶基因有gastrin、ENA-78、SOX18、Pax7等[3]。ZBP-89可以通過直接結合來穩定p53的表達，通過促進p53在核內的滯留而提高其轉錄活性，引起細胞周期阻滯和凋亡[4]。目前關于ZBP-89的表達調控的研究顯示HIF-1a在細胞水平上可以上調ZBP-89的表達，并且ZBP-89啟動子上有潛在的HIF-1a僅結合位點，但兩者在肝癌組織中的相關性未見報道，本研究通過實驗數據論證ZBP-89在肝癌及癌旁組織中的表達陽性率，分析轉錄蛋白ZBP-89與肝癌組織細胞的相關性及肝癌組織中ZBP-89對于肝癌細胞增殖凋亡的影響，通過實驗鏡下觀察收集數據說明ZBP-89與缺氧信號調控因子HIF-1α蛋白的相關性，進一步論證ZBP-89通過抑制缺氧信號因子HIF-1α的轉錄來抑制肝癌細胞的增殖生長，現報道如下。

1材料和方法

1.1材料? 本階段實驗研究總共收集深圳市龍華區人民醫院普通外科和深圳市人民醫院肝膽胰外科2016年8月～2018年8月原發性肝癌手術后石蠟固定病理標本共120組，其中男性91例，女性29例，所有肝癌患者均未接受過術前新輔助放化療及生物治療。每組包括：①腫瘤組織：在肝癌手術標本中心留取肝癌組織;②癌旁組織：均取自距離腫瘤邊緣2 cm以上正常肝組織。

1.2試劑與儀器? 選用兔抗人ZBP-89多克隆抗體和鼠抗人HIF-1α單克隆抗體均由Santa Cruz公司提供，免疫試劑盒SP-9001由北京中衫金橋技術公司生產提供;Nikon TE2000-U顯微鏡。

1.3方法? 免疫組化染色：先行將2種石蠟病理標本切片脫蠟，用磷酸鹽緩沖液沖洗15 min，反復沖洗3次。然后將切片放于pH 9.0的緩沖液中修復，在微波中修復20 min（95℃），冷卻30 min后，再次緩沖液沖洗3次，再加入山羊血清進行封閉，至于溫箱（37℃）放置1 h，然后滴加一抗（1∶200稀釋兔抗ZBP-89多克隆抗體），放入冰箱靜置12 h，復溫后用緩沖液沖洗3次，滴加生物素二抗（1∶100稀釋鼠抗人HIF-1α單克隆抗體），置于37℃溫箱15 min，再次用緩沖液沖洗3次;然后滴加DA染色液顯色，用水中止反應，蘇木素復染、脫水、封片，鏡下觀察結果。

1.4觀察指標? 免疫組化染色后，鏡下觀察120組病理標本中肝癌組織及癌旁組織中轉錄蛋白ZBP-89的表達陽性結果、肝癌組織細胞中ZBP-89與HIF-1α的表達陽性結果。ZBP-89和HIF-1α的表達陽性評分標記參考已發表的文獻[5，6]。

1.5統計學方法? 使用SPSS 15.0進行統計學分析，計數資料均以？字2檢驗表示，使用Pearson相關系數判斷相關性;實驗數據非正態分布資料使用Mann-Whitney檢驗，判斷相關性用Spesarn等級相關及Spesan秩相關檢驗，使用Spearman等級相關及秩相關檢驗判斷相關性。檢驗水準α=0.05，P<0.05差異有統計學意義。

2結果

2.1 ZBP-89在肝癌組織及癌旁組織中的表達? ZBP-89在肝癌組織中呈現出低表達狀態，陽性表達主要位于肝癌細胞細胞核及胞漿;而在癌旁組織中卻呈現出高表達狀態，分別為34.17%（41/120）、62.50%（75/120）; ZBP-89在癌旁組織中表達高于肝癌組織（P<0.05）（圖1）。HIF-1α在肝癌組織中呈現高表達狀態（P<0.05）（圖2）。

2.2 ZBP-89與缺氧信號調控因子HIF-1α的相關性分析? 在總肝癌病理標本中ZBP-89與缺氧信號調控因子HIF-1α蛋白的表達呈現負相關性（？字2=9.606， P=0.002），見表1。

3討論

實體瘤微環境通常存在缺氧，缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）居于核心調控位置[7]。HIF-1由α亞基和β亞基組成，其中α亞基受細胞內氧氣濃度精密調控，對HIF-1功能的發揮起關鍵作用;在常氧條件下α亞基極易被脯氨酸羥化酶（PHD）羥基化，然后與pVHL 蛋白靶向結合，最后經泛素化蛋白酶途徑而被降解;在正常氧狀態下，HIF-1α的半衰期<5 min。而缺氧條件時α亞基的羥基化作用被完全抑制，致使α亞基和β亞基發生異二聚化并轉運進入細胞核，然后通過招募轉錄共激活因子p300/CBP，與靶基因的啟動子上的缺氧反應元件（hypoxia response elements，HREs）相結合，調控多種缺氧反應基因[8]。前期研究發現，Notch1基因啟動子上含有多個HRE，HIF-1α過表達可增加肝癌細胞Notch1、EpCAM、CD13蛋白的表達，提示Notch1可能為HIF-1α下游靶基因。因此，在缺氧微環境中HIF-1α/Notch1通路對肝癌干細胞“干性”的維持起重要作用。

研究發現[9]，ZBP-89在腫瘤組織中普遍存在表達異常，但同腫瘤的關系尚不清楚，且主要集中在ZBP-89的轉錄調控功能上。基于本課題組前期研究結果，再結合ZBP-89可協同或促進p53、p21、pdcd4蛋白引起腫瘤細胞產生凋亡的相關文獻報道，推測ZBP-89很可能為肝癌發生、發展過程中一個潛在的抑癌基因。抑制HIF-1α/Notch1信號通路進而抑制肝癌干細胞增殖、增強肝癌干細胞對化療藥物的敏感性，可能是其發揮抑癌效應的重要機制。對HIF-1α的啟動子的分析發現，HIF-1α的啟動子上均存在多個Sp1的可能結合位點，文獻亦報道Sp1可同HIF-1α的啟動子結合影響其表達。因ZBP-89常可競爭結合基因啟動子上Sp1的結合位點，所以我們推測ZBP-89同HIF-1α啟動子上的Sp1結合位點結合進而抑制HIF-1α的轉錄可能是其抑制HIF-1α表達的主要機制之一。

本研究通過免疫組化方法對ZBP-89在肝癌組織細胞中及癌旁細胞重的蛋白質表達進行檢測，發現ZBP-89在62.50%的肝癌旁組織細胞中呈現高表達狀態，在34.16%的肝癌組織細胞中呈現高表達狀態，由此可見ZBP-89在肝癌組織中的表達明顯低于其在癌旁組織中的表達。查閱相關文獻顯示[11]：肝癌組織中的ZBP-89的過度表達可能誘導肝癌細胞的凋亡，進而抑制肝癌細胞的生長。而相關研究發現，HIF-1α在細胞水平上可以上調ZBP-89的表達。本研究在組織學上進一步驗證了HIF-1α和ZBP-89的關系，二者在肝癌組織細胞中呈現負相關性。

由此可見，以HIF-1α/Notch1通路為腫瘤治療的靶點，可更有效地消除肝癌干細胞，提高肝癌的治療效果。ZBP-89表達上調后肝癌干細胞標記物EpCAM、CD13的表達減少，HIF-1α和Notch1的表達也顯著降低，因此，我們推測ZBP-89很可能為肝癌發生、發展過程中一個潛在的抑癌基因。通過抑制HIF-1α/Notch1通路進而抑制肝癌干細胞增殖、增強肝癌干細胞對化療藥物的敏感性，可能是其發揮抑癌效應的重要機制。該研究有利于進一步揭示ZBP-89的生物學功能，增強其對肝癌預后判斷的準確性，有望為肝癌治療提供新的思路。

參考文獻：

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收稿日期：2019-7-5;修回日期：2019-7-15

編輯/肖婷婷