全基因組測序在食品安全預(yù)防中的利劍作用

推薦單位：國家食品安全風(fēng)險評估中心

成果來源：國家食品安全風(fēng)險評估中心

科研代表：王偉? ? 轉(zhuǎn)化作者：倪影

談?wù)勅蚪M測序，認識它和我們健康息息相關(guān)的疾病預(yù)防、食品安全方面的關(guān)系。

2016年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的一份報告將威脅人類健康和生命的矛頭直指受到污染的食品。報告稱，全球范圍內(nèi)每年有多達6億人因食用受到污染的食品而生病，全球每年有42萬人因食源性疾病死亡。

沙門氏菌是引發(fā)全球性的食源性疾病的主要致病菌之一，世界衛(wèi)生組織（WHO）已經(jīng)將其列為具有中等危害和嚴重危害的食物傳播性病原。蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個體。2006～2010年間我國報告的病因明確的細菌性食源性疾病暴發(fā)事件中，70%～80%是由沙門氏菌所致。同時，其所造成的疾病負擔(dān)，經(jīng)濟損失、醫(yī)療負擔(dān)和社會負擔(dān)等都不容忽視。

因此，建立快速、有效的檢測方法對沙門氏菌進行檢測，將在食品安全保障、公共衛(wèi)生監(jiān)測以及禽病預(yù)防和控制中發(fā)揮巨大作用。另外，沙門氏菌耐藥性的不斷增強一直以來也是備受關(guān)注的全球性問題，通過對耐藥性的監(jiān)測，可以為防控沙門氏菌疫情暴發(fā)、合理使用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。近年來，發(fā)展迅速的全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）在這方面功不可沒，尤其是在對食源性疫情暴發(fā)的檢測和監(jiān)控方面起著至關(guān)重要的作用，相信全基因組測序在不久的將來在食品安全方面將發(fā)揮非常重要的作用。

何為全基因組測序？基因組攜帶著生物個體的遺傳信息，基因組測序能夠加深對生物個體分子機制的理解。所謂全，指把物種細胞里面完整的基因組序列從第1個DNA開始一直到最后一個DNA，完完整整地檢測出來，并排列好，由此能夠鑒定出基因組上任何類型的突變，包含著所有基因和生命特征之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。當然，全基因組測序的實現(xiàn)離不開更高的測序技術(shù)支撐。

測序技術(shù)，簡單說來是將DNA中的信息轉(zhuǎn)變?yōu)橛嬎銠C可處理的數(shù)字信息。基因組測序技術(shù)作為人類探索生命奧秘的重要手段之一，對生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展起到了巨大的推動作用。

目前為止，測序技術(shù)可以分為三個階段，或三代測序技術(shù)。

第一代測序技術(shù)以1977年出現(xiàn)的sanger測序技術(shù)為標志。一代技術(shù)的成本高，通量低，速度慢。

第二代測序技術(shù)以roche公司的454技術(shù)，illumina公司的solexa技術(shù)和ABI公司的solid技術(shù)的誕生為標志。與一代測序技術(shù)相比，二代測序技術(shù)不僅保持了高準確度，而且降低了測序成本，提高了測序速度。二代測序的出現(xiàn)，使得全基因組測序進入了新的紀元。

第三代測序技術(shù)緊隨第二代測序技術(shù)出現(xiàn)，helicos和pacific公司推出了新的測序儀，與前2代技術(shù)相比，最大的特點是實現(xiàn)了單分子測序。該技術(shù)實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序，被認為是第三代測序技術(shù)的開啟。

歐盟曾對傳統(tǒng)細菌分離鑒定和全基因組測序分析進行過成本和時間的比較：使用傳統(tǒng)生化和分型方法，要完成對于樣本中細菌的分離鑒定、血清分型、耐藥檢測、分子分型等一系列檢測，可能需要幾天到幾周的時間，總花費在360甚至1360歐元。而借助全基因組測序技術(shù)，從拿到菌株到得到全部信息，只需要1～2天的時間，并且其成本僅為50～100歐元。

因為對于傳統(tǒng)生化和分型方法而言，不同的細菌需要有其特定的試劑、操作流程和方法;同時，準備工作繁瑣、操作復(fù)雜，且細菌之間的比較僅能通過個別指標或基因位點來分析。對于全基因組測序，可允許幾個病原體同時測序，從而使實驗室操作更簡單、更快、更便宜;同時，可利用細菌全基因組的特異性基因位點進行細菌間比對分析，極大提高特異性、靈敏度和分辨率，達到株水平的鑒定。

不難看出，全基因組測序能夠?qū)⒍鄠€實驗流程整合為一;是對傳統(tǒng)技術(shù)的更進，也是代替;能夠更精確地提供信息;且信息量更大，性價比更高。

鑒于全基因組測序的優(yōu)點，全基因組測序數(shù)據(jù)的高度特異性能夠改進病例定義，實現(xiàn)快速診斷;借助監(jiān)視雷達，全基因組測序數(shù)據(jù)的高靈敏度可以將看似零星的散發(fā)病例相關(guān)聯(lián);通過遺傳進化關(guān)系分析，全基因組測序?qū)χ虏【斐傻氖称肺廴尽⒓膊”l(fā)進行溯源分析，從而有效加強對疫情的管理。

全基因組測序的應(yīng)用，是食品安全疫情監(jiān)測與研究領(lǐng)域的重要一步。全基因組測序能夠精確鑒定引起食源性疾病的菌株，將成為預(yù)防食源性疾病爆發(fā)的利器，在疾病暴發(fā)時可以更快地采取行動，鑒定致病微生物;同時，具備單核苷酸多態(tài)性分析，有助于理解目標生物體的進化史，提供細節(jié)供傳染病學(xué)家們清楚地了解疾病的傳播途徑，揭示細菌暴發(fā)過程中發(fā)生的一系列小規(guī)模的基因突變，追蹤暴發(fā)的源頭，開展毒性特點和耐藥性分析。

2014年4月-6月，英國借助全基因組測序?qū)崿F(xiàn)沙門菌引起食源性疾病的原因食品溯源。當時，在歐盟各國暴發(fā)了350例沙門菌感染，通過流調(diào)發(fā)現(xiàn)，可能與使用生產(chǎn)商供應(yīng)的雞蛋制作的食品有關(guān)，于是英國在英格蘭5家餐館采集雞蛋、環(huán)境樣品、以及病人樣品，同時與其他國家的沙門菌爆發(fā)菌株進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)這次暴發(fā)的菌株聚集成一簇，且菌株間突變很小，最后得出結(jié)論，歐盟各國350例沙門菌患者食用同一污染沙門菌雞蛋。

在我國，全基因組測序在食品安全應(yīng)用方面也有新的突破，發(fā)現(xiàn)了食源性碳青霉烯耐藥沙門菌。國家食品安全風(fēng)險評估中心作為國家食品安全風(fēng)險監(jiān)測、評估、預(yù)警和標準制定機構(gòu)，從2002年開始就在全國范圍內(nèi)開展污染物和致病菌的風(fēng)險監(jiān)測和評估工作。一直以來非常關(guān)注食源性致病菌的耐藥性問題，了解我國食源性沙門菌的NDM-1的流行情況。

2014年，國家食品安全風(fēng)險評估中心微生物室在對山東某大型屠宰場采集屠宰后準備發(fā)貨的整雞樣品的風(fēng)險監(jiān)測過程中，對141份樣品進行沙門菌分離鑒定，后期抗生素藥敏實驗發(fā)現(xiàn)有1株印第安納血清型的沙門菌，對測試的11類抗生素的全部21種抗生素耐藥，僅對替加環(huán)素和多粘菌素敏感，可以說達到泛耐藥的水平。隨后用美羅培南Etest條進行確認，為碳青霉烯耐藥沙門菌，同時PCR擴增發(fā)現(xiàn)菌株攜帶NDM-1基因，質(zhì)粒傳遞性檢測發(fā)現(xiàn)，其能夠?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸埃希氏菌中，轉(zhuǎn)移頻率在2.2× 10-4左右。

為了更深入地研究其耐藥機制和毒力等特性，提取菌株的基因組DNA后進行了pacbio平臺三代完成圖測序。最后，對blaNDM-1耐藥基因環(huán)境于NCBI中的菌株進行了比對，發(fā)現(xiàn)這株雞肉來源的沙門菌NDM-1基因同其他多種耐藥基因位于一個一類整合子上，兩側(cè)被IS26的插入元件包括，整合子、插入序列同質(zhì)粒一樣，都屬于可移動元件，能都介導(dǎo)耐藥基因在菌株間傳遞和轉(zhuǎn)移。它同臨床來源的大腸、弗氏檸檬酸桿菌和肺克具有高度同源性，提示，該基因環(huán)境可能已經(jīng)在臨床環(huán)境中發(fā)生傳播。

這是我國屠宰后整雞中blaNDM-1基因陽性印第安納沙門菌首次報道。在監(jiān)測工作過程中成功運用全基因組測序?qū)κ吃葱蕴记嗝瓜┠退幧抽T菌的耐藥機制進行了分析，發(fā)現(xiàn)菌株含有一個攜帶blaNDM-1基因等多重耐藥基因的大質(zhì)粒，鑒于該菌株表現(xiàn)為泛耐藥（XDR），同時攜帶多種耐藥基因、毒力因子和重金屬抗性基因，一旦在環(huán)境、動物和消費者中傳播，造成的潛在生態(tài)和健康危害將非常嚴重。同時，研究結(jié)果對加強肉雞養(yǎng)殖、屠宰、運輸、銷售、消費等全食物鏈中多重耐藥沙門菌的耐藥監(jiān)測，研究其傳播機制，從而預(yù)防和控制多重耐藥沙門菌，指導(dǎo)肉雞養(yǎng)殖企業(yè)合理使用抗生素具有著重要意義。