熊果酸/PF127/TPGS-多柔比星混合納米膠束的制備及其體外釋藥特性研究

陳洋洋 耿雪 屈子卉 李雪瑩 王琪 霍元子 郝若祎 閻雪瑩

中圖分類號 R943;R944.9 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2789-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.11

摘 要 目的：制備熊果酸（UA）/Pluronic F127（PF127）/聚乙二醇維生素E琥珀酸酯（TPGS）-多柔比星（DOX）混合納米膠束，并對其進行表征和體外釋藥特性研究。方法：采用薄膜水化法制備UA/PF127/TPGS納米膠束;以UA包封率為指標，結合單因素試驗結果，通過L9（34）正交試驗設計對處方中的UA投藥量、PF127與TPGS的摩爾比、水化溫度、水化體積進行優化并驗證。在琥珀酰化TPGS的基礎上，合成TPGS-DOX，與UA/PF127/TPGS混合制備UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，考察其外觀、粒徑、臨界膠束濃度（PF127/TPGS），采用透析袋擴散法考察其體外釋藥行為。結果：UA/PF127/TPGS納米膠束的最優制備工藝為UA投藥量8 mg、PF127與TPGS的摩爾比3 ∶ 7、水化溫度50 ℃、水化體積4 mL，所得納米膠束中UA的平均包封率為89.00%（RSD=0.43%，n=3）。在此基礎上所制UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液澄清且帶有乳光;呈類球形且大小均勻，平均粒徑為（115.00±9.42）mm;PF127/TPGS（摩爾比3 ∶ 7）的臨界膠束濃度為0.001 3%。該混合納米膠束中UA、DOX的體外釋放均較其原料藥或對照品明顯減緩，膠束中兩種藥物的釋藥過程均符合Weibull方程。結論：本研究成功制備了UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，其粒徑均勻且系統穩定性好，并具有較好的緩釋效果。

關鍵詞 熊果酸;多柔比星;Pluronic F127;聚乙二醇維生素E琥珀酸酯;混合納米膠束;正交試驗;體外釋放

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To prepare Ursolic acid （UA）/Pluronic F127 （PF127）/TPGS-doxorubicin （DOX） mixed nanomicelles， and to characterize it and study its in vitro release behavior. METHODS： UA/PF127/TPGS nanomicelles were prepared by thin film hydration method. Using encapsulation efficiency of UA as index， combined with the results of single factor tests， L9（34） orthogonal test was used to optimize drug dosage of UA， molar ratio of PF127 to TPGS， hydration temperature and hydration volume， validation test was performed. On the basis of succinylated TPGS， TPGS-DOX was synthesized and mixed with UA/PF127/TPGS to prepare UA/PF127/TPGS-DOX mixed nanomicelles， the appearance， particle size and critical micelle concentration （PF127/TPGS） were investigated. The drug release behavior was examined by dialysis bag diffusion method. RESULTS： The optimal preparation technology of UA/PF127/TPGS nanomicelles was as follows as drug dosage of UA 8 mg， molar ratio of PF127 to TPGS 3 ∶ 7， hydration temperature 50 ℃， hydration volume 4 mL. Average encapsulation efficiency of UA in nanomicelles was 89.00% （RSD=0.43%， n=3）. The prepared UA/PF127/TPGS-DOX mixed nanomicelles solution was clear with opalescence. The nanomicelles were spherical and uniform in size; average particle size was （115.00±9.42） nm; critical micelle concentration of PF127/TPGS （molecular ratio 3 ∶ 7） was 0.001 3%. The in vitro drug release of UA and DOX in the mixed nanomicelles was significantly slowed down， compared with raw materials or substance control. The drug release process of the two drugs in the nanomicelles conformed to Weibull equation. CONCLUSIONS： UA/PF127/TPGS-DOX mixed nanomicelles are successfully prepared with uniform particle size， good stability and good sustained-release effect.

KEYWORDS? ?Ursolic acid; Doxorubicin; Pluronic F127; TPGS; Mixed nanomicelles; Orthogonal test; Release in vitro

熊果酸（Ursolic acid，UA）屬于五環三萜類化合物，具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗高脂血癥等，但由于其水溶性差、生物利用度低，使得該化合物的應用受到極大限制[1-2]。多柔比星（Doxorubicin，DOX）是從鏈球菌色素代謝物中分離出來的一種蒽環類化合物，被認為是最有效的化療藥之一，是諸多類型癌癥臨床治療的一線用藥[3]。DOX水溶性好，但長期使用會導致多藥耐藥，而有研究表明，UA可抑制上述多藥耐藥性，兩藥聯用具有一定的協同作用[4]。

Pluronic F127（PF127）是一種ABA型的三嵌段共聚物，由聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷（PEO-PPO- PEO）構成[5]。在各種類型的Pluronics中，PF127在生物醫學領域中的應用最為廣泛，其由PPO疏水性嵌段構成的內核可作為疏水性藥物的微環境，PEO親水性嵌段則可防止結合蛋白質的吸附和聚集[6]。聚乙二醇維生素E琥珀酸酯（TPGS）具有兩親性，被美國FDA認定為安全的藥用輔料，可作為增溶劑、增塑劑、乳化劑、穩定劑等應用于藥物制劑中[7-8];此外，TPGS也可用于前體藥物的合成，可與其他共聚物形成混合載體以提高藥物的溶解度、滲透性及穩定性，從而實現緩釋、控釋及靶向作用，以促進藥物的吸收[9]。本研究將疏水性藥物UA包載于PF127和TPGS形成的混合膠束（TPGS-PF127）內核中，初步嘗試制備UA/PF127/TPGS，并優化其制備處方工藝[10];同時參考文獻方法[11]，在琥珀酰化TPGS的基礎上，利用其末端羧基與親水性藥物DOX上的氨基結合，合成TPGS-DOX;又將上述TPGS-DOX與TPGS-PF127作為共同載體，制備UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，并對其進行表征以及體外釋藥行為考察，以期為該制劑的后續體內代謝研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）;R-205B型旋轉蒸發儀、W202B型恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）;TGL-16C型離心機（上海安亭科學儀器廠）;HJ-6A型數顯恒溫磁力攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司）;BT25S型分析天平（德國Sartorius公司）;UV9100型紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）;470型傅里葉紅外變換光譜儀（美國Nicolet公司）;400型核磁共振光譜儀（美國Bruker公司）;JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）;Zetasizer Nano-ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀（英國Malvern公司）。

1.2 藥品與試劑

UA對照品（長沙麓園生物科技有限公司，批號：LYUA-20141218012，純度：≥98%）;UA原料藥（南京道斯夫生物科技有限公司，批號：141202R，純度：>98%）;鹽酸多柔比星對照品（DOX·HCl，北京華奉聯博化學材料有限公司，批號：HF150728，純度：>98%）;PF127（德國BASF公司，批號：140215）;TPGS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：T110277）;琥珀酸酐（SA）（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150128）;二環己基碳二亞胺（DCC，批號：Z23A6Y9）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，批號：Z31A8N42796）均購自上海源葉生物科技有限公司;透析袋（截留分子量：8 000～14 400 Da，美國Sigma公司）;0.22 μm微孔濾膜（天津市領航實驗設備股份有限公司）;甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇、三乙胺（TEA）、二甲基亞砜（DMSO）等其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 UA含量測定

采用HPLC法測定。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.5%磷酸水溶液（85 ∶ 15，? ? V/V）;檢測波長：210 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;進樣量：20 μL。

2.1.2 溶液的配制 ①UA貯備液：精密稱取UA對照品4.01 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質量濃度為401.00 μg/mL的UA貯備液。②供試品溶液：精密稱定處方量UA原料藥，固定摩爾比的PF127、TPGS以及一定量的TPGS-DOX，用乙醇溶解，旋轉蒸發揮去有機溶劑，于室溫真空干燥箱中靜置過夜，得透明干燥的含藥薄膜。將上述薄膜用適量水進行水化，于適宜溫度水浴中以700 r/min攪拌30 min，冷卻至室溫，即得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束供試品溶液。③陰性對照溶液：按“2.1.2②”項下方法制備不含UA、DOX的空白膠束溶液，即得陰性對照溶液。

2.1.3 專屬性考察 分別取“2.1.2”項下UA貯備液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。結果顯示，在該色譜條件下，UA峰形較好，保留時間約為14.9 min;DOX在此波長下無吸收，TPGS、PF127等對UA的測定無干擾，表明本方法專屬性良好。

2.1.4 線性關系考察 分別取“2.1.2①”項下UA貯備液適量，用乙醇稀釋，制得質量濃度分別為40.10、100.25、200.50、300.75、401.00 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質量濃度為橫坐標（c，μg/mL）、其峰面積為縱坐標（A）進行線性回歸，得線性回歸方程為A=6 127.2c-99 354（R2=0.999 2）。結果，UA檢測質量濃度的線性范圍為40.10～401.00 μg/mL。

2.1.5 定量限與檢測限考察 取“2.1.4”項下40.10 μg/mL的UA對照品溶液適量，用乙醇逐級稀釋，并按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。當信噪比為10 ∶ 1時，得UA定量限為2.23 μg/mL;當信噪比為3 ∶ 1時，得UA檢測限為0.808 μg/mL。

2.1.6 精密度、準確度、重復性、加樣回收率和穩定性試驗 參照2015年版《中國藥典》（四部）要求[12]進行精密度、準確度、重復性、加樣回收率和穩定性試驗。結果，精密度、準確度、重復性、加樣回收率均符合藥典相關規定，供試品溶液在室溫下放置24 h基本穩定。

2.2 DOX含量測定

采用HPLC法測定。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：磷酸緩沖液[500 mL水中加入磷酸0.68 mL、十二烷基硫酸鈉（SDS）1.44 g]-乙腈-甲醇（500 ∶ 500 ∶ 60，V/V/V）;檢測波長：254 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液的配制 ①DOX貯備液：精密稱取DOX·HCl對照品4.00 mg，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS，含20%乙醇）溶解并定容至100 mL量瓶中，制得質量濃度為40.00 μg/mL（以DOX·HCl質量計，下同）的DOX貯備液。②供試品溶液：按“2.1.2②”項下方法制備供試品溶液。③陰性對照溶液：按“2.1.2③”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性考察 分別取“2.2.2”項下DOX貯備液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖2。結果顯示，在該色譜條件下，DOX峰形較好，保留時間約為10.5 min;UA在此波長下無吸收，TPGS、PF127等對DOX的測定無干擾，提示本方法專屬性良好。

2.2.4 線性關系考察 取“2.2.2①”項下DOX貯備液適適量，用乙醇稀釋，制得質量濃度分別為4.00、8.00、16.00、32.00、40.00 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質量濃度為橫坐標（c，μg/mL）、其峰面積為縱坐標（A）進行線性回歸，得線性回歸方程為A=2585 080c-29 936（R2=0.999 9）。結果，DOX檢測質量濃度的線性范圍為4.00～40.00 μg/mL。

2.2.5 定量限與檢測限考察 取“2.2.4”項下40.00 μg/mL的UA對照品溶液適量，用乙醇逐級稀釋，并按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析。當信噪比為10 ∶ 1時，得DOX定量限為2.263 μg/mL;當信噪比為3 ∶ 1時，得DOX檢測限為0.608 μg/mL。

2.2.6 精密度、準確度、重復性、加樣回收率和穩定性試驗 參照2015年版《中國藥典》（四部）要求[12]進行精密度、準確度、重復性、加樣回收率和穩定性試驗。結果，精密度、準確度、重復性、加樣回收率均符合藥典相關規定，供試品溶液在室溫下放置24 h基本穩定。

2.3 UA包封率和載藥量測定

精密量取所得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，經0.22 μm微孔濾膜濾過后，取續濾液，用乙醇稀釋，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，并采用標準曲線法計算其被包封的UA含量（m包封）;精密量取UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，不經濾過處理，同法離心后取上清液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，并采用標準曲線法計算UA的總量（m總）。包封率（%）=（m包封/m總）×100%，載藥量（%）=[m包封/（m投藥+m載體）]×100%（式中，m投藥為UA投藥量，m載體為載體總量）[13-14]。

2.4 UA/PF127/TPGS納米膠束處方工藝優化

采用薄膜水化法[15]制備UA/PF127/TPGS納米膠束：稱取一定量的UA原料藥以及一定摩爾比的載體材料PF127、TPGS（載體材料共100 mg），置于同一100 mL茄型瓶中，加入適量有機溶劑使其充分溶解，于45 ℃下旋轉蒸發1 h以揮干有機溶劑，殘渣于室溫真空干燥箱中靜置過夜，即得透明干燥的含藥薄膜。將上述含藥薄膜用一定量的水進行水化后，于一定溫度水浴中以700 r/min攪拌30 min，冷卻至室溫，即得。

2.4.1 單因素試驗 參考現有研究[13]，以納米膠束溶液澄清程度為指標，對有機溶劑種類進行考察;以UA包封率為考察指標，對UA投藥量、PF127與TPGS的摩爾比、水化溫度、水化體積等進行單因素考察。各因素水平均平行操作3次，結果見表1、表2（表1中，“++”表示澄清，“+”表示較澄清，“-”表示渾濁）。由表1、表2可見，以乙醇作為溶劑，可獲得澄清的納米膠束溶液;當UA投藥量為8 mg、PF127與TPGS的摩爾比為3 ∶ 7、水化溫度為37 ℃、水化體積為4 mL時，所得UA/PF127/TPGS納米膠束的包封率相對較高。

2.4.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以UA投藥量（A）、PF127與TPGS的摩爾比（B）、水化溫度（C）、水化體積（D）為考察因素，以UA包封率為考察指標，采用L9（34）表進行正交試驗，每個因素取3個水平。因素與水平見表3，正交試驗設計與結果見表4，方差分析結果見表5。

由表4、表5可見，4個因素對UA包封率的影響程度依次為B>D>A>C;除因素C外，其余因素對試驗結果的影響均有統計學意義（P<0.05）;最優處方工藝為A3B3C2D2，即UA投藥量為8 mg、PF127與TPGS的摩爾比為3 ∶ 7、水化溫度為50 ℃、水化體積為4 mL。

2.4.3 驗證試驗 按“2.3.2”項下最優處方工藝平行制備3批UA/PF127/TPGS納米膠束，并按“2.1”項下方法測定UA含量，再按“2.3”項下方法計算UA包封率和載藥量，結果見表6。

2.5 TPGS-DOX的合成與表征

2.5.1 合成 取相同質量的TPGS、SA，通過開環反應合成琥珀酰化的TPGS-SA。精密稱定或量取TPGS-SA 574.82 mg、DOX·HCl對照品307.51 mg、DCC 222.63 mg、NHS 124.38 mg、TEA 150 μL，置于適量DMSO中，在氮氣保護下室溫反應24 h。所得產物作透析處理后，依次用DMSO、水清洗，冷凍干燥，即得紅色粉末狀的TPGS-DOX[11]。TPGS-DOX的合成過程見圖3。

2.5.2 表征 ①紅外光譜：稱取DOX·HCl對照品、TPGS-DOX各10 mg，采用傅里葉紅外變換光譜儀檢測，其紅外光譜分別見圖4A、4B;對照TPGS紅外圖譜（圖4C[16]）判定反應是否成功。結果，DOX在3 300～3 500 cm-1處可見其氨基的特征吸收峰（雙峰），而該雙峰在TPGS-DOX的紅外光譜中消失;TPGS在1 738、1 108 cm-1處分別可見羰基和醚鍵的特征吸收峰，而上述吸收峰在TPGS-DOX的紅外光譜中均有所減弱（見圖4畫圈處），提示UA的氨基已與TPGS中的羧基連接成功。

②氫譜（1H-NMR）：稱取DOX·HCl對照品、TPGS、TPGS-DOX各適量溶于DMSO-d6中，使用核磁共振光譜儀檢測，其氫譜見圖5。由圖5可見，DOX在3.99、5.45 ppm處有特征吸收峰;TPGS在3.51 ppm處有特征吸收峰;TPGS-DOX的氫譜包含TPGS的特征吸收峰，且在8.0～8.1 ppm處存在酰胺鍵的特征吸收峰，但DOX的特征吸收峰變小，提示DOX已通過酰胺鍵與TPGS結合。

③HPLC定性分析：取DOX·HCl對照品、TPGS- DOX各適量，按“2.2”項下方法測定，記錄色譜圖，見圖6。由圖6可見，DOX的保留時間約為10.5 min，而TPGS-DOX的保留時間約為9.4 min，且未見游離DOX的色譜峰。

2.6 UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束的制備及表征

2.6.1 制備 分別精密稱取UA原料藥8 mg、PF127 78 mg、TPGS 21.4 mg以及TPGS-DOX 0.6 mg，置于同一100 mL茄型瓶中，加乙醇5 mL使其充分溶解，在45 ℃下旋轉蒸發1 h以揮去有機溶劑，殘渣于室溫真空干燥箱中靜置過夜，即得透明干燥的含藥薄膜。取上述含藥薄膜適量，于50 ℃水浴條件下加水4 mL進行水化。在700 r/min轉速下恒速攪拌30 min，冷卻至室溫，即得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液。

2.6.2 形態觀察與粒徑測定 取“2.6.1”項下所得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，滴至鋪有碳膜的銅網上，用2.0%磷錫酸溶液染色，自然干燥，使膠束粒子在銅網上濃縮沉積，于透射電子顯微鏡下觀察其形態并拍照。室溫條件下，取上述UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，用水稀釋后，采用納米粒度及Zeta電位分析儀檢測其粒徑。結果，所得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液澄清且帶有乳光;鏡下呈類球形，且大小均勻、分散良好;平均粒徑為（115.00±9.42）mm，詳見圖7、圖8。

2.6.3 臨界膠束濃度（CMC）測定 采用I2探針增溶的紫外-可見分光光度法以紫外-可見分光光度計檢測PF127/TPGS水溶液I2吸光度隨其濃度（濃度為0.000 01%～0.1%）變化的趨勢圖。結果，摩爾比為3 ∶ 7的PF127/TPGS水溶液的CMC為0.001 3%，介于PF127 （0.003 5%）和TPGS（0.03%）之間，且系統穩定性較好（臨界膠束濃度越低，膠束越穩定[17]），詳見圖9。

2.7 體外釋藥特性研究

采用透析袋擴散法檢測。取按最優處方工藝制得的UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液、UA原料藥、DOX·HCl對照品各8 mL，分別裝入透析袋中，以含20%乙醇的PBS為釋放介質（總體積為50 mL），于37 ℃下以100 r/min恒速振搖。分別于釋放的0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h取樣2 mL（取樣后補充同體積釋放介質），經0.45 μm微孔濾膜濾過后，再分別按“2.1.1”“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。采用標準曲線法計算其中UA、DOX的含量，計算累積釋放率（Q），并繪制體外釋藥曲線，再分別用零級動力學、一級動力學、Weibull、Higuchi、Niebergull、Hixcon-Crowell、Ritger- Peppas等方程對其體外釋藥行為進行擬合，結果見圖10、表7。

由圖10可見，UA、DOX體外釋藥迅速，分別約于12、6 h釋放完全，而UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中UA、DOX的釋放均明顯放緩。由表7可見，UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中藥物的體外釋藥過程均符合Weibull方程（UA、DOX的R2分別為0.960 2、0.919 3）。

3 討論

DOX抗瘤譜較廣，是一種重要的化療藥，但由于其慢性毒性（可導致心臟、肝臟、大腦和腎臟損傷）和急性毒性（惡心、嘔吐、心律失常等）導致其應用受到了一定的限制[18]。UA來源于天然產物，具有抗多藥耐藥以及保肝護肝、保護心血管的功效[19-20]。Zong L等[4]研究發現，UA不僅可提高DOX的療效，而且還能逆轉細胞對DOX的多藥耐藥。因此，本研究選擇DOX和UA作為模型藥物，制備UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，以期為兩藥聯合治療癌癥提供理論支持。

3.1 色譜條件的優化

本研究首先建立了檢測UA和DOX質量濃度的HPLC法。在前期研究中，本課題組考察了不同流動相比例、檢測波長、流速、柱溫等因素對其定量分析的影響。結果發現，檢測UA時以流動相為乙腈-0.5%磷酸水溶液（85 ∶ 15，V/V）、檢測波長為210 nm、流速為1.0 mL/min、柱溫為25 ℃，檢測DOX時以流動相為磷酸緩沖液（500 mL水中加入磷酸0.68 mL、SDS 1.44 g）-乙腈-甲醇（500 ∶ 500 ∶ 60，V/V/V）、檢測波長為254 nm、流速為1.0 mL/min、柱溫為25 ℃，兩者的色譜峰峰形均較好，且方法學考察結果符合2015年版《中國藥典》（四部）的相關要求[12]。

3.2 混合納米膠束載體的選擇

混合納米膠束是近年來研究的熱點之一，其可通過不同嵌段共聚物來協同發揮包載藥物的藥理作用，可提高膠束的穩定性和藥物的包封率，可優化膠束的粒徑分布，并延長載藥系統在體內的滯留時間[21]。PF127是一種多功能材料，在水溶液中能自發聚集形成膠束，將難溶性藥物包裹于其中，可明顯提高藥物的溶解性和穩定性[5-6]。但PF127的CMC較高，當用溶劑稀釋時易發生不穩定的現象;而當其與TPGS共同構成混合載體時，所得混合膠束的CMC明顯降低;加之TPGS結構中含有芳香環，可使混合膠束的疏水核體積增大，難溶藥物更易進入膠束的疏水核內，從而提高了藥物的包封率和載藥量[15]。鑒于此，本課題組選擇PF127和TPGS為混合載體制備混合納米膠束。

3.3 混合納米膠束的制備及體外釋藥特征分析

本研究曾采用薄膜水化法、自組裝法、透析法、乳化溶劑揮發法以及納米沉淀法制備混合納米膠束，由于薄膜水化法制備的膠束的包封率、載藥量、粒徑均優于其他方法，故選擇該法首先制備了包載單藥的UA/PF127/TPGS納米膠束，將疏水性藥物UA包載于納米膠束的疏水內核中;并通過正交試驗優化UA/PF127/TPGS的處方工藝，制得了包封率較高的UA/PF127/TPGS納米膠束。隨后，將TPGS琥珀酸化，利用其末端羧基與DOX上的氨基進行鍵合反應，形成酰胺鍵;通過IR、1H-NMR、HPLC法證實TPGS-DOX已被成功合成。根據上述最優處方工藝，將UA、PF127、TPGS與TPGS-DOX混合，進一步制備了UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，并對其理化性質進行了一系列的表征和體外釋藥特性研究。在進行UA/PF127/TPGS-DOX納米膠束體外釋藥特性研究時，溶出介質的選擇至關重要，故本研究在2015年版《中國藥典》（四部）[12]和已有文獻[22]的基礎上，選用含20%乙醇的PBS作為溶出介質。體外釋藥特性研究結果顯示，與單一UA、DOX比較，UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中兩藥的釋放均明顯減緩，提示其具有一定的緩釋特性;同時，UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中兩種藥物的體外釋藥行為符合Weibull方程，提示其釋藥與溶液滲透所致擴散和載體松弛分散這一雙重因素有關[23]。

綜上所述，本研究利用PF127和TPGS自身特點，實現了對疏水性UA和親水性DOX的共同裝載，構建了混合載藥納米膠束，為溶解性差異較大的藥物聯用提供了新的設計思路。但本研究僅進行了膠束的處方工藝優化和體外釋藥行為的研究，仍有待后續進一步開展體內藥動學與藥效學分析，為其臨床應用奠定基礎。

參考文獻

[ 1 ] 張皓.熊果酸載藥納米微球的制備及其體內外抗腫瘤的效果評價[D].南京：南京醫科大學，2015.

[ 2 ] 邱琳，趙修華，祖元剛，等.熊果酸納米粒的乳化溶劑蒸發制備工藝、表征及溶出特征[J].中草藥，2018，49（10）：2387-2393.

[ 3 ] 高燕.抗腫瘤藥多柔比星新型遞送系統的研究進展[J].藥物生物技術，2018，25（3）：273-276.

[ 4 ] ZONG L，CHENG G，LIU S，et al. Reversal of multidrug resistance in breast cancer cells by a combination of ursolic acid with doxorubicin[J]. J Pharm Biomed Anal，2019. DOI：10.1016/j.jpba.2018.11.057.

[ 5 ] AKASH MS，REHMAN K. Recent progress in biomedical applications of Pluronic（PF127）：pharmaceutical perspectives[J]. J Control Release，2015. DOI：10.1016/j.jconrel.2015.04.032.

[ 6 ] 嚴兆坤.熊果酸Pluronic F127納米膠束的制備及其對大腸癌細胞生長的影響[D].福州：福建中醫藥大學，2017.

[ 7 ] 鄭楠楠，唐景玲，吳琳華.聚乙二醇維生素E琥珀酸酯作為藥物載體的最新進展[C]//2013中國藥學大會暨第十三屆中國藥師周論文集.南寧：中國藥學會，2013：1-8.

[ 8 ] ZHANG Z，TAN S，FENG SS. Vitamin E TPGS as a molecular biomaterial for drug delivery[J]. Biomaterials，2012，33（19）：4889-4906.

[ 9 ] 錢薇，于兆慧，朱云澤.人參稀有皂苷Compound K混合膠束的處方優化及體外評價[J].中國藥房，2016，27（28）：3988-3991.

[10] BUTT AM，AMIN MC，KATAS H，et al. In vitro characterization of Pluronic F127 and D-α-tocopheryl polyethy- lene glycol 1 000 succinate mixed micelles as nanocarriers for targeted anticancer-drug delivery[J]. J Nanomaterials，2012. DOI：10.1155/2012/916573.

[11] CAO N，FENG S. Doxorubicin conjugated to D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1 000 succinate（TPGS）：conjugation chemistry，characterization，in vitro and in vivo evaluation[J]. Biomaterials，2008，29（28）：3856-3865.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：368-370、374-377.

[13] YUE C，YANG Y，ZHANG C，et al. ROS-responsive mitochondria-targeting blended nanoparticles：chemo- and photodynamic synergistic therapy for lung cancer with on-demand drug release upon irradiation with a single light source[J]. Theranostics，2016，6（13）：2352-2366.

[14] 潘超，劉會麗，許俊鵬，等.抗腫瘤藥H6聚合物膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究[J].中國藥房，2017，28（4）：533-536.

[15] 黃仁杰，鄢雪梨，陳虎彪.蛇葡萄素混合納米膠束的制備及體外評價[J].中國中藥雜志，2016，41（6）：1054-1058.

[16] 俞紅凱.表面活性劑TPGS的合成及其在辛伐他汀微乳制劑中的應用[D].沈陽：沈陽藥科大學，2005.

[17] 蔣燕平，牛麗娜，梁桂賢，等.低分子肝素-阿霉素聚合物膠束的制備及體外細胞增殖抑制作用研究[J].中國新藥雜志，2019，28（2）：195-201.

[18] 顧覺奮.多柔比星毒副作用機制及其防治研究進展[J].國外醫藥抗生素分冊，2017，38（4）：145-151.

[19] 湯濤，董偉，張婧，等.中藥單體成分逆轉腫瘤多藥耐藥的研究進展[J].中草藥，2017，48（4）：792-797、846.

[20] 張明發，沈雅琴.熊果酸和齊墩果酸的血管藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2017，40（10）：1510-1519.

[21] ATTIA ABE，ONG ZY，HEDRICK JL，et al. Mixed micelles self-assembled from block copolymers for drug delivery[J]. Cur Opin Colloid Interface Sci，2011，16（3）：182-194.

[22] 齊娜，劉廣，廖迎，等.熊果酸脂質體的制備及體外釋放特性考察[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（2）：28-31.

[23] 宗蕊，王翠，郭童林，等.槲皮素Pluronic P123/Poloxamer 188混合膠束體外釋放和藥代動力學研究[J].中國藥理學通報，2019，35（2）：246-250.

（收稿日期：2019-01-18 修回日期：2019-07-26）

（編輯：張元媛）