水石榴中總黃酮的提取工藝優化

李金洲 陳勇 陳子雋 呂培群 林玉港 盧慧敏 黃艷茹

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2807-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.14

摘 要 目的：建立水石榴中總黃酮的含量測定方法，并優化其提取工藝。方法：以三氯化鋁為顯色劑，采用紫外-可見光分光光度法測定水石榴中總黃酮的含量。在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度、提取次數為考察因素，以水石榴中總黃酮含量為指標，采用Plackett-Burman試驗篩選對總黃酮含量有顯著影響的因素，利用最陡爬坡試驗確定最佳取值范圍，再結合Box-Behnken響應面法優化總黃酮的提取工藝。結果：總黃酮的檢測質量濃度線性范圍為0.012～0.036 mg/mL（r=0.999 9）;精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于3%;加樣回收率為92.98%～99.86%（RSD=2.71%，n=6）。優化所得提取工藝為乙醇體積分數60%，料液比1 ∶ 34（g/mL），提取次數3次，提取時間60 min，提取溫度80 ℃;在此工藝條件下，水石榴中總黃酮的平均含量為2.71%（RSD=1.69%，n=6），與模型預測值（2.64%）的相對誤差為2.65%。結論：所建含量測定方法穩定性、重復性均較好，可用于測定水石榴中總黃酮的含量;優化所得提取工藝穩定、可行。

關鍵詞 水石榴;總黃酮;提取工藝;Plackett-Burman試驗;Box-Behnken響應面法;紫外-可見光分光光度法;含量測定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for content determination of total flavonoids from Combretum alfrdii， and to optimize the extraction technology of total flavonoids from C. alfrdii. METHODS： Using aluminium trichloride as， chromogenic agent， UV spectrum was adopted to determine the content of total flavonoids from C. alfrdii. Based on single factor test， ethanol volume fraction， material-liquid ratio， extraction time， extraction temperature and times were selected as investigation factors， and the content of total flavonoids was selected as response value， Plackett-Burman design was used to screen the factors that had significant influence on the content of total flavonoidsfrom C. alfrdii. Then steepest climbing test was adopted to confirm the optimum valuing range; the extraction technology of total flavonoids was optimized by Box-Behnken response methodology. RESULTS： The linear range of total flavonoids were 0.012-0.036 mg/mL （r=0.999 9）; RSDs of precision， stability and repeatability tests were less than 3%; the recovery ranged from 92.98% to 99.86% （RSD=2.71%， n=6）. The optimal extraction technology included that 60% ethanol， material-liquid ratio of 1 ∶ 34 （g/mL）， extracting for 3 times， lasting for 60 min， extraction temperature of 80 ℃. Under this technology， average content of total flavonoids from C. alfrdii was 2.71% （RSD=1.69%， n=6）， and the relative error was 2.65% compared with predicted value of the model （2.64%）. CONCLUSIONS： Established method is stable and reproducible， and can be used for content determination of total flavonoids from C. alfrdii. The optimized extraction method is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Combretum alfrdii; Total flavonoids; Extraction technology; Plackett-Burman experiment; Box-Behnken response surface methodology; UV spectrophotometry; Content determination

水石榴為使君子科風車子屬植物風車子（Combretum alfrdii Hance）的干燥根、莖、葉，別名水番桃、清涼樹，是廣西壯族和瑤族等少數民族常用藥材，主產于廣西、廣東、云南等地，其性平、淡，味微苦、甘，常被用于治療黃疸型肝炎、蛔蟲病、消化不良等疾病[1]。有文獻報道，水石榴主要含有二苯乙烯類、三萜類、菲類及黃酮類等化學成分[2]。黃酮類化合物廣泛存在于多種植物中，對心血管系統、生殖系統、消化系統、內分泌系統、神經系統均具有較好的藥理作用[3-4]。目前對于水石榴的研究主要集中在其化學成分研究方面[5-7]，尚未見對其黃酮類成分的提取工藝及含量測定的相關研究。為此，本研究采用紫外-可見光分光光度法測定水石榴中總黃酮的含量，通過Plackett-Burman試驗結合Box-Behnken響應面法優化其總黃酮的提取工藝，旨在為水石榴中總黃酮的質量控制以及藥材資源的有效利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV1780型紫外-可見光分光光度計（日本Shimadzu公司）;SQP型分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）;SDFY-200A型高速萬能粉碎機（上海比朗儀器有限公司）;UPC-11-10T型優普系列超純水器（四川優普超純科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

蘆丁對照品（上海融禾醫藥科技有限公司，批號：131105，純度：≥99%）;三氯化鋁（分析純，廣東光華科技股份有限公司）;乙醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）;水為超純水。

1.3 藥材

水石榴藥材（編號：S1～S10），來源見表1，經廣西中醫藥大學藥學院郭敏副教授鑒定為使君子科風車子屬植物風車子（C. alfrdii Hance）的干燥莖與葉。藥材經粉碎后，過50目篩，密封保存，備用。

2 方法與結果

2.1 水石榴中總黃酮的含量測定

采用紫外-可見光分光光度法測定水石榴中總黃酮的含量。

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品12.0 mg，置于50 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋并定容，即得質量濃度為0.24 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取藥材樣品粉末1.00 g，置于50 mL錐形瓶中，加70%乙醇30 mL，稱定質量，于70 ℃水浴加熱回流提取1 h，放冷，用70%乙醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 顯色劑的制備 取三氯化鋁18.10 g，置于1 000 mL量瓶中，加水溶解并定容，即得1%三氯化鋁水溶液。

2.1.4 空白對照溶液的制備 取70%乙醇1 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入“2.1.3”項下1%三氯化鋁水溶液5 mL進行顯色反應，加70%乙醇定容，作為空白對照溶液。

2.1.5 檢測波長的確定 以上述空白對照溶液在400～800 nm波長范圍內進行基線調零，取對照品溶液和供試品溶液適量，在400～800 nm波長范圍內掃描，結果見圖1。由圖1可知，對照品溶液、供試品溶液分別在410、406 nm波長處有最大吸收，空白對照溶液在對應波長處均無吸收，故確定406 nm為檢測波長。

2.1.6 線性關系考察 取“2.1.1”項下對照品溶液0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加“2.1.4”項下1%三氯化鋁水溶液5 mL進行顯色反應，再加70%乙醇稀釋至刻度，得質量濃度分別為0.012、0.018、0.024、0.030、0.036 mg/mL的系列線性工作溶液。將上述工作溶液于45 ℃水浴加熱20 min后，冷卻至室溫，于406 nm波長處測定吸光度。以蘆丁質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得蘆丁回歸方程為y=24.093 4x+0.017 410 3（r=0.999 9），結果表明蘆丁在0.012～0.036 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 取“2.1.1”項下對照品溶液1 mL，按“2.1.4”項下方法顯色反應并定容后，于406 nm波長處連續測定6次吸光度。結果，蘆丁吸光度的RSD=0.17%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號：S10）1 mL，按“2.1.4”項下方法顯色反應并定容后，分別于室溫下放置5、10、20、30、40、50、60 min時，于406 nm波長處測定吸光度。結果，蘆丁吸光度的RSD=0.74%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置60 min內基本穩定。

2.1.9 重復性試驗 取藥材樣品粉末（編號：S10），共6份，每份1.0 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下方法顯色反應并定容后，于406 nm波長處測定吸光度。并入計算方法按公式[總黃酮含量（%）=c測×DV1/mV2×100%。式中，c測為總黃酮的實際測得濃度，D為稀釋倍數，V1為溶劑體積，m為藥材樣品質量，V2為取樣量]計算樣品中總黃酮的含量。結果，總黃酮的平均含量為1.75%，RSD=2.46%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取藥材樣品粉末（編號：S10），共6份，每份0.2 g，分別加入質量濃度為0.218 mg/mL的對照品溶液16 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下方法顯色反應并定容后，于406 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結果見表2。

2.1.11 樣品含量測定 取10批藥材樣品粉末各約1.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項下方法顯色反應并定容后，于406 nm波長處測定吸光度。平行操作3次，并按“2.1.9”項下公式計算總黃酮的含量。結果，10批藥材樣品中總黃酮的平均含量為1.70%～2.10%。

2.2 水石榴中總黃酮提取工藝單因素試驗

參考相關文獻[8]進行水石榴中總黃酮提取工藝單因素試驗。

2.2.1 乙醇體積分數 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取次數為1次、提取溫度為70 ℃、提取時間為60 min的條件下，考察不同乙醇體積分數（10%、30%、50%、70%、95%）對總黃酮含量的影響，詳見圖2A。由圖2A可知，隨著乙醇體積分數的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現先增加后降低的趨勢;當乙醇體積分數為30%時，總黃酮的含量最高，故選擇乙醇體積分數為30%乙醇。

2.2.2 料液比 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定乙醇體積分數為70%、提取次數為1次、提取溫度為70 ℃、提取時間為60 min的條件下，考察不同料液比（1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50，g/mL）對水石榴中總黃酮含量的影響，詳見圖2B。由圖2B可知，隨著料液比的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現逐漸增加的趨勢;當料液比>1 ∶ 20（g/mL）時，總黃酮的含量增加不明顯。考慮節約溶劑，故選擇料液比為1 ∶ 20（g/mL）。

2.2.3 提取溫度 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定乙醇體積分數為70%、料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取次數為1次、提取時間為60 min的條件下，考察不同提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對總黃酮含量的影響，詳見圖2C。由圖2C可知，隨著提取溫度的增加，總黃酮的含量呈現逐漸增加的趨勢;當提取溫度為80 ℃時，總黃酮的含量最高，繼續增加提取溫度，其含量不再增加，故選擇提取溫度為80 ℃。

2.2.4 提取時間 取藥材樣品粉末，共15份，每份1.0 g，分為5組，固定乙醇體積分數為70%、料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取次數為1次、提取溫度為70 ℃的條件下，考察不同提取時間（30、60、90、120、150 min）對總黃酮含量的影響，詳見圖2D。由圖2D可知，隨著提取時間的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現先增加后略有降低的趨勢，雖然在提取時間為90 min時總黃酮的含量最高，但與提取時間為60 min時無明顯差異。考慮到節約時間和成本，故選擇提取時間為60 min。

2.2.5 提取次數 取藥材樣品粉末，共9份，每份1.0 g，分為3組，固定乙醇體積分數為70%、料液比為1 ∶ 30（g/mL）、提取溫度為70 ℃、提取總時間為60 min的條件下，考察不同提取次數（1、2、3次）對總黃酮含量的影響，詳見圖2E。由圖2E可知，隨著提取次數的增加，藥材提取后總黃酮的含量呈現逐漸增加的趨勢;當提取時間為3次時，總黃酮的含量最高，故選擇提取次數為3次。

2.3 水石榴中總黃酮提取工藝優化

2.3.1 Plackett-Burman試驗 在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）、提取次數（E）為考察因素，以總黃酮含量（Y）為指標，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行Plackett-Burman試驗[8]，每個因素取2個水平。因素與水平見表3，試驗方案設計與結果見表4，方差分析結果見表5。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4數據進行多項式擬合回歸，得回歸方程為Y=2.50+0.27A+0.24B-0.04C+0.00D+0.19E（P=0.045 6<0.05），這表明方程擬合顯著性具有統計學意義。方差分析結果顯示，5個因素對總黃酮含量影響的大小順序為：A>B>E>C>D。

2.3.2 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman試驗結果，選擇對總黃酮含量具有顯著性影響的因素，即乙醇體積分數和料液比進行最陡爬坡試驗，再根據其效應大小，設定變化方向和步長，以逼近其最佳取值范圍[9-10];同時結合單因素試驗結果，確定提取次數為3次、提取時間為60 min、提取溫度為80 ℃，結果見表6。

2.3.3 Box-Behnken響應面法 在Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗的基礎上進行Box-Behnken試驗。以乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取次數（E）為自變量，以總黃酮含量（Y）為因變量，采用3因素3水平設計試驗[11-12]，同時結合單因素試驗結果確定提取時間為60 min、提取溫度為80 ℃。因素與水平見表7，試驗設計方案與結果見表8。

采用Design Expert 8.0.6軟件對表8數據進行二次多元擬合，得Y=3.37-0.04A-0.02B+0.55E+0.06AB-0.04AE-0.05BE-0.24A2-0.33B2-0.51E2（R=0.996），這提示模型擬合度及預測性均較好。對模型進行方差分析，結果見表9。由表9可知，所建模型擬合顯著性具有統計學意義（P<0.01），表明模型與實際情況吻合良好;模型失擬項顯著性無統計學意義（P=0.073 6），表明未知因素對模型擬合結果干擾小，模型誤差較小。

2.3.4 響應面分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，以乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取次數（E）為響應因子，以總黃酮含量為響應值，繪制響應面和等高線圖[13]，詳見圖3。 由圖3可知，在因素A與B的交互作用下，總黃酮的含量呈現先增加后降低的趨勢;在因素A與E的交互作用下，總黃酮的含量呈現逐漸增加的趨勢;在因素B與E的交互作用下，總黃酮的含量呈現逐漸增加的趨勢。

2.3.5 最優提取工藝的確定 基于Design-Expert 8.0.6軟件分析得到水石榴中總黃酮的最優提取工藝為：乙醇體積分數59.18%，料液比1 ∶ 33.63（g/mL），提取次數3.18次，提取時間60 min，提取溫度80 ℃;總黃酮含量預測值為2.64%。考慮到實際操作的可行性，確定最優提取工藝為：乙醇體積分數60%，料液比1 ∶ 34（g/mL），提取次數3次，提取時間60 min，提取溫度80 ℃。

2.3.6 驗證試驗 按最優提取工藝平行操作6次，結果顯示，水石榴中總黃酮的平均含量為2.71%（RSD=1.69%，n=6），與預測值的相對誤差為2.65%，提示所得最優工藝條件穩定、可靠。

3 討論

Plackett-Burman試驗設計是基于各因素間無交互影響時，以優選因素主效應而進行的多因素高、低兩個水平的試驗設計，主要用于因素較多且未確定的因素對于響應變量有顯著性影響的情況。但該試驗設計不能區分主效應與交互作用的影響，僅能確定具有顯著性影響的因素[14]。本研究通過Plackett-Burman試驗發現，乙醇體積分數與料液比是影響水石榴中總黃酮含量的顯著性因素。隨后進行最陡爬坡試驗以確定這兩個因素的正、負效應，正效應即當增大因素水平時，總黃酮含量由低變高，反之則為負效應。通過設計合理的步長、增加試驗的密集度，以逼近總黃酮含量最高值，確定2個顯著性因素的最佳取值范圍。

Box-Behnken響應面的擬合方程僅在考察指標緊接區域范圍時才能充分反映近似真實情形，在其他區域的擬合方程與近似函數方程幾乎無相似之處，意義不大[15]。因此，本研究在Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗的基礎上結合Box-Behnken響應面法，對水石榴中總黃酮的提取工藝進行優化，可提高試驗的精度和預測性[16]。

在測定總黃酮含量時，本課題組曾嘗試以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色體系進行顯色，并在400～800 nm 波長范圍內進行全波長掃描，結果發現供試品溶液在500 nm波長處沒有特征吸收。隨后改用以三氯化鋁法顯色，結果發現供試品溶液在406 nm波長處有最大吸收，且與對照品在410 nm波長處的吸收峰接近，故本研究采用三氯化鋁法顯色。進一步對顯色條件進行優化，如取供試品溶液0.3 mL，分別考察加入不同劑量顯色劑（2、3、4、5、6 mL）、顯色時間（5、10、15、20、25 min）、顯色溫度（25、35、45、55、65 ℃）時的吸光度，結果發現當顯色劑劑量為5 mL、顯色時間為20 min、顯色溫度為45 ℃時的吸光度最高。

本研究所得最優提取工藝為：乙醇體積分數60%，料液比1 ∶ 34（g/mL），提取次數3次，提取時間60 min，提取溫度80 ℃。在此條件下，水石榴中總黃酮含量為2.71%。

綜上所述，本研究所建含量測定方法穩定性、重復性均較好，可用于測定水石榴中總黃酮的含量;優化所得提取工藝穩定、可行。

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（收稿日期：2019-04-02 修回日期：2019-08-22）

（編輯：陳 宏）