豬單核源性巨噬細胞受FSL.1刺激后IncRNAs的鑒定與特征分析

趙為民　方曉敏　涂楓　周李生　李碧俠　王學敏　付言峰　任守文

摘要：lncRNA是新近發現的一種具有重要功能的RNA分子，在各種生理活動中發揮著重要作用。為鑒定豬單核源性巨噬細胞受FSL-1刺激后相關的lneRNA，利用二代測序技術結合生物信息學對lncRNA進行了組裝與特征分析。結果顯示FSL-1刺激成功地構建了細胞炎癥模型，試驗組與對照組共鑒定到l056個lncRNA轉錄本，其對應于831個基因座，這些lneRNA的平均長度為1643 bp，平均外顯子數為2.4個。相對于對照組，試驗組有51個IncRNA.上調表達，44個lncRNA下調表達。在上調lncRNA兩側相鄰的蛋白質編碼基因參與免疫反應、炎癥反應、病毒反應等通路，而在下調lncRNA兩側相鄰的蛋白質編碼基因參與的通路較少，不參與上述通路。定量PCR結果顯示挑選的4個lncRNA的差異倍數與RNA-Seq的結果相似，其中上調的IncRNA呈現一定的組織特異表達，而下調的lncRNA呈現多組織表達。這些結果為進一步研究IncRNA在FSL-1介導的炎癥反應中的作用奠定了基礎。

關鍵詞：豬;IneRNA;單核源性巨噬細胞;FSL-1;炎癥

中圖分類號：S828

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0346-11

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，ln-cRNA）是一類不具有編碼蛋白質能力而本身長度超過200 bp的RNA分子。基于其在基因組上相對于蛋白質編碼基因的位置主要可分為3種：基因間長鏈非編碼RNA（Long intervening non-coding RNA，lineRNA），自然反義鏈（Natural antisense transcript，NAT）和內含子長鏈非編碼RNA（Intronic long non-coding RNA）。lncRNA 由于其較低的物種間保守性在最初大量發現時被認為是轉錄噪音，不具有生物學功能"。隨著近年對lncRNA研究的不斷深入，lncRNA受到越來越多的關注，其功能從最初參與的X染色失活[2]到后來的細胞亞小體生成[3]、細胞重編程[4]胚胎發育[5]、干細胞多能性[6]、肌與脂肪生成[7-8]、腫瘤癌癥[9-10]等各種細胞生命活動中。

天然免疫系統是宿主抵御病原體入侵的第一道防線，其介導宿主的早期炎癥反應對機體在抵抗病原體感染過程中發揮著關鍵作用”。然而炎癥反應中炎癥因子的紊亂表達會影響宿主對病原體感染的抵抗，研究結果表明，肺部炎癥因子的紊亂表達與宿主對支原體肺炎的易感性密切相關[12-13]。炎癥因子的釋放由宿主PRRs與PAMP的識別以及細胞內復雜的信號轉導等一系列事件構成[11]，越來越多的研究結果表明炎癥因子的釋放不僅受到一些經典的相關蛋白質基因和miRNA調控[11，14]，IncRNA在其中也發揮著重要的調控作用[15-16]，因而探索lncRNA在炎癥反應中的作用對深入了解炎癥因子的精確調控具有重要意義。

巨噬細胞作為宿主與外界病原體之間天然免疫反應的關鍵防線，其與病原體之間的互作情況對宿主的感染進程有重要的決定作用[17-20]。來源于外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PM-BC）在體外培養時通過添加粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）可形成單核源性巨噬細胞（Monocyte-derived macrophage，MDM）[21]。相對于屠宰豬獲取的巨噬細胞，MDM的獲取簡單方便，因而可對不同品種、不同年齡階段豬種進行持續穩定的研究。

本研究通過RNA-Seq結合生物信息學分析對豬單核源性巨噬細胞受支原體脂蛋白FSL-1刺激后的IneRNA進行鑒定與特征分析，為進一步研究IncRNA在FSL-1介導的炎癥反應中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑

RNA提取試劑盒Direct-zolTM RNA Kits 購于Zymo research 公司，DNA marker、cDNA反轉錄試劑盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM II定量試劑盒購于TaKa-Ra公司，DMEM培養基、0.25%胰酶、1640培養基、青鏈霉素、胎牛血清購于Thermofisher公司，豬外周血單個核細胞分離液KIT購于天津TBD公司，GM-CSF購于RD system公司，FSL-1購于InvivoGen公司。

1.2 豬單核巨噬細胞的培養及FSL-1刺激

豬來源于江蘇省農業科學院六合動物科學基地，蘇山豬種，采用豬外周血單個核細胞分離液KIT分離3頭健康豬外周血單核細胞，全培養基（10%FBS+90%RPMI1640）中添加終質量濃度20ng/mlGM-CSF培養7d，每2.5d換1次液，得到豬單核源性巨噬細胞121-22，設置對照組與試驗組，每組3個生物學重復。試驗組加入終質量濃度100ng/ml的FSL-1，對照組加入相應的PBS，刺激6h后收集細胞提取RNA。

1.3 RNA測序的文庫構建

RNA提取參照試劑盒說明書操作，并進行DNaseI處理，純化及回收。DNaseI處理效果用PCR檢測，引物見表1，Agilent 2100分析RNA的完整性，當RNA完整性相關參數RIN≥8，28S/l8S≥1.5時可進行測序文庫的構建。RNA測序文庫依據NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for llumina的說明操作，簡單如下：提取總RNA先進行poly+A的純化，然后進行eDNA第一鏈及第二鏈的合成，再對cDNA產物進行末端修復，3'末端加A和加A-dapter，最后進行連接產物的純化回收，上樣測序，產出原始數據Raw reads。

1.4 轉錄本的構建及lncRNA的鑒定流程

Rawreads經過去除Adapter、ploy-N以及低質量的Reads，得到Clean reads。然后通過HISAT2將Clean reads比對豬基因組Sserofa11.1，基于比對結果用StringTie組裝轉錄本，從NCBI和Ensemble上分別下載豬的蛋白質編碼基因的位置信息（染色體及其起始終止位置），版本分別為NCBI AnnotationRelease：106（豬的蛋白質編碼基因以NM_和XM_開頭）和Ensemble release 91（Protein_coding）。采用以下步驟來鑒定lncRNA：（1）過濾小于200bp長度以及表達量極低的轉錄本（FPKM<0.01）;（2）去除和NCBI以及Ensemble中豬蛋白質編碼基因位置重疊的轉錄本;（3）去除Coding potential calculator（CPC）（231 tool>0的轉錄本;（4）去除NCBI blastX中有對應蛋白質數據庫UniProtKB/Swiss-Prot（swis-sprot）的轉錄本（E-value<10-'）;（5）將剩余的轉錄本翻譯成相應氨基酸序列，使用隱馬爾可夫模型（Hidden markov models，HMMs）對Pfam蛋白質庫進行比對，去除在Pfam中有對應的轉錄本;最終剩余的轉錄本為lncRNA。

1.5 差異IncRNA的保守性與重復序列分析

用HTseq對組裝的轉錄本進行表達水平的定量分析，然后使用DEseq2對組間的lncRNA進行表達差異分析。將變化倍數（Fold change）≥2以及錯誤發現率FDR<0.05作為差異表達的篩選標準。通過Ensemble數據庫下載入和小鼠的IncRNA序列，利用BLASTN比對程序，分析差異lncRNA與人和小鼠lncRNA之間的保守性。利用RepeatMasker網站對差異lncRNA序列中可能存在的重復序列元件類別進行在線分析。在Search engine中選擇Cross_match，在DNA source中選擇物種Pig，其它選擇參數為默認。

1.6 差異IncRNA兩側蛋白質編碼基因的GO與KEGG分析

以上述NCBI Annotation Release：106和Ensemble Release 92的蛋白質編碼基因為數據庫，選擇差異lncRNA兩側相鄰的蛋白質編碼基因，使用DA-VID（Database for annotation，visualization and integrated discovery）對這些蛋白質編碼基因進行GO（Gene ontology）和KEGG pathway（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析，研究這些蛋白質編碼基因參與的生物學功能與途徑。篩選條件選擇Count=2，EASE=0.05，Fold enrichment≥1.5。

1.7 差異IncRNA定量PCR驗證

對照組與試驗組RNA反轉錄成cDNA，分別挑選2個上調和下調的lncRNA進行qPCR驗證，以HPRT作為內參基因，在ABI 7500儀器上進行定量PCR反應，對照組與試驗組各3個生物學重復，每個樣品技術重復3次。熒光定量PCR按照試劑盒說明書操作，定量數據用2-00“法處理，差異比較采用獨立樣本t檢驗。引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 RNA質量及其測序文庫數據分析

經過Agilent 2100 bioanalyzer檢測后發現6個樣本RNA的RIN為9.0～9.4，28S/18S為2.1～2.5，符合RNA測序文庫的構建要求。通過在IL1B外顯子_上設計不夸內含子的擴增引物來確認RNA中是否有DNA污染。我們對RNA DNase I處理前后的結果進行了驗證，直接以DNase I處理前后的RNA為模板進行PCR擴增，同時以豬基因組和Pegfp-N1作為陽性與陰性對照。圖1A和圖1B顯示在DNase I處理前，對照組與試驗組的RNA里均能擴增出IL1B產物，DNaseI處理后均擴增不出IL1B產物，說明DNase I處理能消除RNA樣品中的DNA。RNA測序方面，6個樣本中經過RNA-Seq產出的Cleandata在6.52～7.35Gb，GC含量都在53%左右，其Q20百分比都在95%以上，Q30百分比都在90%以_上。

2.2 差異蛋白質編碼基因參與的生物學過程

對豬的蛋白質編碼基因分析發現，相對于對照組，試驗組有1295個蛋白質編碼基因呈現變化倍數。對這些差異表達的蛋白質編碼基因進行GO的生物學過程分析發現，這些差異基因一共參與327個生物學進程，其中最顯著富集的第1到第10個進程依次排序為GO：0006954（炎癥反應）、GO：0006955（免疫反應）、GO：0032496（脂多糖反應）、GO：0071222（細胞對脂多糖反應）、GO：0050729（炎癥反應的正調節）、GO：0030335（細胞遷移的正調節）、GO：0006915（凋亡過程）、GO：0009615（病毒反應）GO：0050731（肽酪氨酸磷酸化的正調節）與GO：0051607（病毒防疫反應）。這些進程涉及到炎癥反應、免疫反應、脂多糖反應、炎癥反應調節、細胞遷移調節、細胞凋亡、病毒響應、肽酪氨酸磷酸化等，而在這前10個進程中有7個涉及到免疫、炎癥及抗病毒反應（圖2）。

2.3 lncRNA的鑒定與結構分析

經過HISAT2比對和StringTie組裝后的轉錄本經過層層過濾后最終得到1056個lIncRNA轉錄本，其對應于831個基因座，這些IncRNA的平均長度為1643bp，平均外顯子數為2.4個。對lncRNA的長度區間進一步分析發現（圖3），在200～500bp與501～1000bp的IncRNA占總數的52%，隨著長度的不斷增加，lncRNA所占的比例逐漸減小。而對于外顯子分布的進一步分析發現，只有1個和2個外顯子的lncRNA占總數的64%，隨著外顯子數目的不斷增加，lncRNA所占的比例也逐漸減小。lIn-cRNA在不同的染色體，上都有不同程度的分布，在Y染色體上的數量最少。

2.4 差異表達IncRNA的鑒定

通過分析與比較，在對照組與試驗組之間共有95個差異表達的lncRNA，相對于對照組，試驗組有51個lncRNA，上調表達（表2），44個lncRNA下調表達（表3）。

2.5 差異表達IncRNA的保守性分析

Ensemble數據庫中人有7856個lncRNA基因，小鼠有5438個lncRNA基因。進行BLASTN比對后，在95個差異的豬lncRNA中有10個IncRNA與人lncRNA同源;而只有1個lncRNA與小鼠ln-cRNA同源（E-value<10-5），分別占到了其總數的10.50%和1.05%，同時與人和小鼠IncRNA同源的有1個lncRNA。在與小鼠lncRNA同源的豬ln-cRNA中，其同源序列長度跨度為327～620bp，平均長度為514bp;在與人lncRNA同源的豬lncRNA中，其同源序列長度跨度為31～1301bp，平均長度為490bp。

2.6 差異表達IncRNA的重復序列分析

通過RepeatMasker分析發現，95個差異ln-cRNA中有81個lneRNA序列中含有重復元件，占到了總數量的85%。對lncRNA序列中重復元件的種類分析發現，短散在重復序列（SINE）和長散在重復序列（LINE）分別占到了重復元件總數的40.4%和17.7%，長末端重復序列（LTR）占到了11.6%，簡單重復占16.9%，這幾種常見的重復元件占到了總重復元件類型的86.6%，剩余的是一些不常見的類型。進一步對不同含量區間的lncRNA分析發現，以10%為1個區間，在含0～10.0%，10.1%～20.0%，20.1%～30.0%，30.1%～40.0%重復元件的lncRNA占總數的10%以上，含50%以上重復元件的lncRNA數量較少（圖4）。

2.7 差異表達lncRNA兩側蛋白質編碼基因的GO與KEGG分析

通過對95個差異表達的IncRNA與豬NCBI和Ensemble蛋白質數據庫染色體位置比較，163個有官方名稱的蛋白質編碼基因處于差異IncaNa兩側。我們對這163個蛋白質編碼基因進行GO與KEGG分析。在GO分析中，這些蛋白質編碼基因共參與了22類生物學進程（圖5）。這22類進程中涉及到信號轉導、抗病毒反應、器官形態發生、細胞增殖、體液免疫等，其中6個進程與病毒反應、免疫反應相關，分別為GO：0009615（病毒反應）、GO：0006959（體液免疫反應）、GO：0051607（病毒防疫反應）、GO：0060337（I型干擾素信號通路）、GO：0070098（趨化因子介導的信號通路）、GO：0002548（單核細胞趨化性）。

對51個上調表達的IncANA兩側的蛋白質編碼基因進行GO分析發現，這些蛋白質編碼基因一共參與了26類生物學進程（圖6）。這26類進程中涉及到信號轉導、趨化因子信號通路、細胞增殖、G蛋白受體信號、器官形態發生等，其中有11個進程涉及到病毒反應、免疫反應、炎癥因子，分別為GO：007008（趨化因子介導的信號通路）、GO：0006955immune response（免疫反應）、GO：000615（病毒反應）、CO0002548（單核細胞趨化性）、GO：000935（趨化性）GO：000959（體液免疫反應）、GO：000954（炎癥反應）、GO：006037（I型干擾素信號通路）、GO：0030593（中性粒細胞趨化性）、GO：0051607（病毒防疫反應）、GO：0071347（細胞對白細胞介素1的反應）。對44個下調表達的IncaNa兩側的蛋白質編碼基因進行GO分析發現，這些蛋白質編碼基因共參與了3類生物學過程（圖7）。這3個過程涉及到DNA重組、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調控、心內膜墊層形成等。

對差異表達的IncANa兩側的163個蛋白質編碼基因進行KEGG

pathway分析發現，這些蛋白質編碼基因總共參與了6個Pathway，這些Pathway涉及到細胞因子受體結合、A型流感、Rapl信號通路美洲錐蟲病、白細胞跨內皮遷移與趨化因子信號通路（圖8），其中絕大部分與免疫反應、炎癥反應相關。對51個上調表達的IncaNa兩側蛋白質編碼基因進行KEGG

pathway分析發現，這些蛋白質編碼基因總共參與了7個Pathway，這些Pathway涉及到細胞因子受體結合、A型流感、Rapl信號通路、類風濕性關節炎、美洲錐蟲病、白細胞跨內皮遷移與趨化因子信號通路（圖9），其中絕大部分也與免疫反應、炎癥反應相關。然而對44個下調表達的Incana兩側的75個蛋白質編碼基因進行KEGG pathway分析時發現沒有Pathway被顯著富集。

2.8 差異表達IncaNa定量PCR驗證

我們在上調和下調的IncANa中分別選取2個Incana進行定量PCR驗證。在上調的2個lncRNA中，Incana-MSTRG.8350的兩側蛋白質編碼基因為CXCL8與CXCL6，通過上述的GO與KEGG注釋顯示它們與免疫反應、趨化因子通路相關;lncRNA-MSTRG.8244其兩側蛋白質編碼基因RHOH與CHRM9分別與信號傳導和白細胞跨內皮遷移相關，與炎癥反應間接相關。下調中的Incana兩側蛋白質編碼基因在GO與KEGG注釋中均沒有涉及到免疫反應、炎癥反應、趨化因子、病毒響應，故隨機選取了2個IncaNa，分別為Incana-MSTRG.3552與Incana-MSTRG.12242。定量PCR結果顯示，與對照組相比Incana-MSTRG.8350和IncanaMSTRG.8244顯著上調（P<0.01），IncRNA-MstrG12242和Incana-MSTRG3552顯著下調（P<0.01）（圖10），上調和下調差異倍數與RNA-seq的差異倍數相似，表4為qPCR差異倍數與RNA-Seq差異倍數比較。

2.9 IncANa組織表達譜

以成年豬的心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、背肌等組織的cDNA為模板，對上述上調和下調的4個Incana進行組織表達譜分析。結果（圖11）顯示在上調的2個Incana中，Incana-MSTRG8350僅在肺中有微弱的表達，不表達于其他組織，Incana-MSTRG.8244在脾中表達相對較高，在肝小腸中表達較弱。在下調的2個IncaNa中，IncaNa-MSTRG.12242與IncaNa-MSTRG.3552均呈現多組織表達

3 討論

IncaNa可通過本身的復雜結構與DNA、RNA或蛋白質之間互作，從而在多種層面上調控炎癥因子的表達水平6.2。從Incana這一新的調控分子去研究炎癥因子的表達調控能更加全面地理解炎癥反應的機理。基于此，本研究通過RNA-Seq測序并結合生物信息學分析對豬單核源性巨噬細胞受支原體脂蛋白FSL-1刺激后的Incana進行了鑒定與特征分析。

支原體細胞膜上的脂質相關膜蛋白是其介導宿主發生天然免疫的重要抗原3，由于絕大部分支原體的脂蛋白結構是雙酰基而不是三酰基6），因而我們在脂蛋白上選取了雙酰基結構的FSL-1脂蛋白，這更好地模擬支原體脂蛋白對細胞的炎癥反應。我們發現在脂蛋白FSL-1刺激細胞后，其差異基因參與的最顯著的通路都集中在炎癥與免疫反應上，這說明FSL-1刺激成功地構建了細胞炎癥模型。我們在Incana的鑒定中由于Incana基因與蛋白質編碼基因的起始位置不重疊，實際上得到是lincrna。lincrna由于不與其他蛋白質編碼基因重疊而具有相對獨立的轉錄單元，這也便于對其表達和調控進行更好的研究。Incana基因一般長度在1kb左右，外顯子數目大多數為1～327。本研究結果顯示Incana平均長度為1643bp，平均外顯子數為2.4個，而且長度在1000bp以下和外顯子數在2以下的Incana都占到了總數的50%以上，表現出較短的長度以及較少的外顯子數，這也與報道相符合，表明我們得到的Incana是可信賴的。IncaNA基因由于部分和經典的蛋白質編碼基因mRNA結構相似，也顯示出一定的轉錄剪接28，我們鑒定的1056個IncanA轉錄本，其對應于831個基因座，這也說明其中有些IncaNa基因發生了選擇性剪接，產生了2個以上的轉錄本。我們發現在差異lncRNA基因中，分別有10.50%和1.05%的Incana與人和小鼠同源，這表明相對于小鼠，豬的Incana與人的更為保守。研究結果表明基因組的重復序列可能是Incana產生的主要來源。我們對差異IncaNa的序列分析發現絕大多數的差異Incana中都含有重復序列，這也與上述結論相符。進一步分析發現短散在重復序列（SINE）占到了差異lncRNA中總重復序列種類的40%，這說明差異lncRNA可能大部分來源于基因間的短散在重復序列區間。

Incana通過順式作用0與反式作用來發揮其重要功能，雖然目前還未有較好的方法來準確預測Incana的功能，然而通常可根據Incana的這些調控方式來預測其功能，一般對Incana兩側蛋白質編碼基因參與的通路來預測Incana可能的功能。在本研究中，我們對差異IncaNa兩側的蛋白質編碼基因進行GO與KEGG分析發現，在GO分類中，差異IncaNa包括上調與下調Incana兩側的蛋白質編碼基因參與了22個生物學過程，其中6個與免疫反應、炎癥反應直接相關，而對上調的lncRNA兩側的蛋白質編碼基因分析發現，它們參與26個生物學過程，其中11個與免疫反應、炎癥反應直接相關，占到了大約一半的比例;而對下調的lncRNA兩側的蛋白質編碼基因分析發現，沒有參與免疫反應、炎癥反應的通路。這說明上調的IncaNa更傾向于富集在與免疫反應、炎癥反應相關的基因兩側，可能具有重要作用。KEG的通路分析結果也與GO分析結果相符合，上調的Incana兩側蛋白質編碼基因幾乎都參與免疫反應、炎癥反應相關的通路，而下調的Incana兩側的蛋白質編碼基因沒有參與生物學進程。我們進一步對上調和下調的Incana進行組織表達譜分析，結果表明位于與炎癥反應相關的蛋白質編碼基因兩側的2個上調In-cRNA，都呈現出一定的組織特異表達，其中一個表現出嚴格的組織表達，而在下調的IncaNa中與此相比都表現出多組織表達。研究結果表明，嚴格的組織表達或時序特異性表達的Incana具有重要功能（30321，這也在一定程度上說明了上調的IncANa尤其是位于與炎癥反應相關的蛋白質編碼基因兩側的IncaNa值得進一步深入研究。

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