UPLC-Q-TOF/MS技術結合UNIFI數據庫快速分析止痛化癥膠囊的化學成分

吳福林 王翠竹 董慶海 王涵 譚靜 林紅強 劉金平 李平亞

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）17-2336-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.07

摘 要 目的：對止痛化癥膠囊（簡稱“ZTHZC”）中的化學成分進行快速鑒定，為進一步闡明其藥效物質基礎和全面質量控制提供參考。方法：采用超高效液相色譜與飛行時間質譜聯用（UPLC-Q-TOF/MS）技術對ZTHZC中化學成分進行分離。通過查閱ZTHZC化學成分及其單味中草藥的化學成分相關的文獻報道，將化學成分的化學結構保存成.mol格式的文件，補充完善UNIFI數據庫。通過UNIFI數據庫篩查，對ZTHZC中化學成分進行定性分析，依據其精確分子質量、特征離子、中性丟失、二級質譜裂解規律、色譜保留行為以及結合對照品信息和文獻報道等對其進行驗證。結果：共鑒定出了70個化學成分，包括 38個有機酸及有機酸酯類、8個生物堿類、9個黃酮類、5個三萜皂苷類、5個醛類、2個酮類、1個醌類、1個聚炔類和1個單萜類化合物。結論：建立的方法能快速檢測、鑒定ZTHZC的化學成分，本研究結果為其質量控制、藥效物質基礎的闡明提供了科學依據。

關鍵詞 止痛化癥膠囊;化學成分;UNIFI數據庫;超高效液相色譜與飛行時間質譜聯用技術

Rapid Analysis of Chemical Components of Zhitong Huazheng Capsules Based on UPLC-Q-TOF/MS Technology Combined with UNIFI Database

WU Fulin，WANG Cuizhu，DONG Qinghai，WANG Han，TAN Jing，LIN Hongqiang，LIU Jinping，LI Pingya（School of Pharmacy， Jilin University， Changchun 130021， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To rapidly identify chemical components of Zhitong huazheng capsules （shorted for “ZTHZC”）， and to provide reference for further elucidating the pharmacodynamic material basis and overall quality control. METHODS： UPLC-Q-TOF/MS method was adopted to separate the chemical components of ZTHZC. By reviewing literatures that related to chemical components of ZTHZC and its single Chinese traditional medicinal crops， the chemical structure of the chemical components was saved into a .mol format file， and supplemented the UNIFI database. The chemical constituents of ZTHZC were qualitatively analyzed by UNIFI database screening， and validated according to their precise molecular mass， characteristic ions， neutral loss， secondary mass spectrometry cleavage， chromatographic retention behavior， combined reference information and literature reports. RESULTS： A total of 70 chemical components were identified in this experiment， including 38 organic acids and organic acid esters， 8 alkaloids， 9 flavonoids， 5 triterpenoid saponins， 5 aldehydes， 2 ketones， 1 quinone， 1 polyacetylene and 1 monoterpenoid. CONCLUSIONS： This study provides a rapid detection and identification method for chemical components of ZTHZC， and also provides a scientific basis for the clarification of ZTHZC’s quality control and pharmacodynamics.

KEYWORDS Zhitong huazheng capsules; Chemical components; UNIFI database; UPLC-Q-TOF/MS

止痛化癥膠囊（簡稱“ZTHZC”）是由黨參、炙黃芪、炒白術、丹參、當歸、雞血藤、三棱等19味中藥炮制而成，主治益氣活血、散結止痛，用于氣虛血瘀所致的月經不調、痛經，癥見行經后錯、經量少、有血塊、行經小腹疼痛，慢性盆腔炎見上述證候者[1]。臨床上將其廣泛用于治療痛經、盆腔炎及子宮腺肌病等婦科疾病[2-5]，療效甚好。目前，對于ZTHZC化學成分的研究主要集中在幾種有效成分（如丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B）的含量測定上[6-8]，制劑中許多其他化學成分還未明確。而中藥復方具有多成分、多靶點的特點，因此，對于ZTHZC藥效物質基礎需要進一步研究。

近年來，超高效液相色譜與飛行時間質譜聯用（UPLC-Q-TOF/MS）技術已經成為天然藥物中活性成分快速分離和鑒定的有力手段。而UNIFI數據庫是一個簡單、高效、全面的平臺，包括從600多種中藥中發現的6 000多種化合物信息，能夠將數據采集、峰提取、分子式確定、數據庫檢索及生成報告相結合，對化學成分進行快速、全面地定性分析[9]。將UPLC-Q- TOF/MS與UNIFI數據庫相結合，已經被應用到傳統中藥及復方中化學成分的快速鑒定中[10-12]。基于此，本研究將采用UPLC-Q-TOF/MS技術結合UNIFI數據庫，對ZTHZC的化學成分進行快速、全面的篩查分析，為進一步闡明其藥效物質基礎以及全面的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS Q-TOF四級桿飛行時間質譜儀、ACQUITY UPLC 二元泵和樣品管理器（美國Waters公司）;N-A35氮氣發生器（上海金浪科技有限公司）;FA1104N 電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）;R501旋轉蒸發儀（上海豫康科教儀器設備有限公司）;TGL-16aR飛鴿超離速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

ZTHZC（吉林金寶藥業股份有限公司，批號：20161010，規格：0.3 g/粒）;木樨草素（批號：111520- 200504）、阿魏酸（批號：110773-201012）、山柰酚（批號：110861-201310）、檸檬酸（批號：111679-201602）、咖啡酸（批號：110885-201102）、咖啡酸乙酯（批號：111678- 200401）、原兒茶醛（批號：110810-200205）、黃芪甲苷（批號：0781-200311）、迷迭香酸（批號：11871-2001102）、雙氫槲皮素（批號：180317）等10個對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（純度：均≥98%）;延胡索乙素（批號：17022720）、黨參炔苷（批號：17062207）、紫草酸（批號：171220）、奎寧酸（批號：20150321）、丹酚酸B（批號：150927）、芒柄花黃素（批號：17031005）、丹參素（批號：151106）、原兒茶酸（批號：171109）、丹酚酸A（批號：171217）、丹酚酸C（批號：171105）等10個對照品均購自北京普天同創生物科技有限公司（純度：均≥98%）;乙腈（美國Fisher公司，色譜級）;甲酸鈉、亮氨酸-腦啡肽（美國Sigma公司，色譜級）;水為屈臣氏純凈水。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

取ZTHZC內容物，研細，過40目篩。取粉末約1 g，用80%甲醇在80 ℃水浴中提取3次，每次3 h，合并3次提取液。將提取液過濾后，將濾液合并，旋干。用80%甲醇1.0 mL將提取物溶解，過0.22 μm濾膜，收集濾液，備用。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱定對照品木樨草素0.001 1 g、阿魏酸0.001 0 g、山柰酚0.001 2 g、檸檬酸0.001 3 g、咖啡酸0.001 5 g、咖啡酸乙酯0.001 6 g、原兒茶醛0.001 8 g、黃芪甲苷0.002 1 g、迷迭香酸0.001 5 g、雙氫槲皮素0.001 9 g、延胡索乙素0.002 5 g、黨參炔苷0.001 1 g、紫草酸0.002 6 g、奎寧酸0.001 4 g、丹酚酸B 0.002 7 g、芒柄花黃素0.002 3 g、丹參素0.002 4 g、原兒茶酸0.002 1 g、丹酚酸A 0.001 6 g、丹酚酸C 0.002 6 g，置于同一10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容，即得。

2.3 檢測條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫：30 ℃;樣品管理器溫度：15 ℃;流動相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，10%B;2～26 min，10%→90%B;26～28 min，90%B;28～29 min，90%→10%B;29～30 min，10%B）;流速：0.4 mL/min;進樣體積：10 μL。

2.3.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI），連續掃描模式，采用正、負離子檢測模式（ESI+、ESI-）;掃描范圍：質荷比（m/z）100～1 500;毛細管電壓：3.0 kV;錐孔電壓：40 V;錐孔氣流量：50 L/h;脫溶劑氮氣流量：600 L/h;氬氣流量：0.15 mL/min;離子化源溫度：120 ℃;脫溶劑氣溫度：300 ℃。采用亮氨酸-腦啡肽[M+H]+質荷比（m/z）為556.277 1、[M-H]- m/z為 554.262 0作為Lock Spray校正標準液（100 pg/mL），對儀器進行實時校正，其校正流速為正離子模式（15 μL/min），使用甲酸鈉溶液對儀器進行校正。

2.4 數據的采集與處理

取“2.1”項下樣品溶液，按“2.3”項下條件進行分析，記錄圖譜。采用UPLC-Q-TOF/MS 模式采集數據，使用UNIFI數據庫軟件進行ZTHZC化學成分的自動識別。第一步，先通過查閱ZTHZC化學成分及其單味中草藥的化學成分相關的文獻報道，將化學成分的化學結構保存成.mol格式的文件，然后導入UNIFI數據庫中，作為原有的傳統中藥庫的補充，并建立了ZTHZC數據庫;第二步，將原始數據通過Waters Compression and Archival Tool v1.10軟件進行壓縮;第三步，應用UNIFI數據庫軟件自動篩查、鑒定化合物，代替傳統的人工提峰、計算分子式以及分析碎片斷裂情況;第四步，建立一個過濾篩選方法，即設定質量誤差為-5～5 ppm，且響應值大于3 000;最后，通過結合碎片離子理論精確質量數、相對保留時間和分子式匹配軟件Elemental composition、化合物結構匹配軟件MassFragment、離線及在線質譜數據庫（PubMed、Mass Bank、Chemspider、METLIN）及相關文獻對各主要化合物進行人工識別和確認。

3 結果

在ZTHZC中共檢測到70個化合物，包括38個有機酸及有機酸酯、8個生物堿、9個黃酮、5個三萜皂苷、5個醛類、2個酮類、1個醌類、1個聚炔類和1個單萜類化合物。ESI+、ESI-模式下的質譜基峰離子流圖見圖1，化合物的鑒定結果見表1，ZTHZC中鑒定出的各類化合物的結構圖見圖2。

3.1 有機酸及有機酸酯類化合物的鑒定

有機酸及有機酸酯類化合物是ZTHZC的主要活性成分，基于UNIFI數據庫所推斷出的裂解碎片，結合相關參考文獻的質譜數據及對照品比對的方法，鑒定出有機酸及有機酸酯類化合物38個，下面以化合物6和化合物65為例，簡述其鑒定過程。

（1）化合物6：在ESI-模式下，化合物6的保留時間為1.03 min，準分子離子峰m/z 196.972 7[M-H]-;以m/z 196.972 7[M-H]-為母離子進行二級質譜（MS/MS）掃描，主要產生3個碎片離子，即m/z 178.966 7[M-H- H2O]-、m/z 152.961 0[M-H-HCOOH] -、m/z 134.993 3[M-H-H2O- HCOOH]-，與丹參素對照品的碎片離子基本一致，再結合文獻[13]報道，可將其鑒定為丹參素。丹參素對照品和化合物6的MS/MS圖見圖3。

（2）化合物65：在ESI-模式下，化合物65的保留時間為25.02 min，準分子離子峰m/z 281.248 7[M-H]-;以m/z 281.248 7[M-H]-為母離子進行MS/MS掃描，主要產生1個碎片離子，即m/z 265.051 7[M-H-CH3]-，再結合文獻[14]報道，可將其鑒定為棕櫚油酸乙酯。化合物65的MS/MS圖見圖4。

3.2 生物堿類化合物的鑒定

在ESI+模式下，生物堿類化合物共鑒定出8個，下面以化合物23為例，簡述其鑒定過程：化合物23保留時間為6.64 min，準分子離子峰m/z 356.185 6[M+H]+，以m/z 356.185 6[M+H]+為母離子進行MS/MS掃描，主要產生5個碎片離子，即分別為m/z 341.158 2[M+H-CH3]+，m/z 310.136 1[M+H-CH3-OCH3]+，m/z 192.100 9[M+H-C10H12O2]+，m/z 178.085 9[M+H-C11H14O2]+， m/z 150.064 5[M+H- C12H15O2N]+，與延胡索乙素對照品的碎片離子基本一致，再結合文獻[15]報道，可將其鑒定為延胡索乙素。延胡索乙素對照品和化合物23的MS/MS圖見圖5。

3.3 黃酮類化合物的鑒定

在ESI-模式下，黃酮類化合物共鑒定出9個，下面以化合物43為例，簡述其鑒定過程：化合物43保留時間為10.51 min，準分子離子峰m/z 267.942 6[M-H]-;以m/z 267.942 6[M-H]-為母離子進行MS/MS掃描，主要產生1個碎片離子，即m/z 251.004 4[M-H-CH3]-，這與芒柄花黃素對照品的碎片離子基本一致，再結合文獻[16]報道，可將其鑒定為芒柄花黃素。芒柄花黃素對照品和化合物43的MS/MS圖見圖6。

3.4 三萜皂苷類化合物的鑒定

在ESI-模式下，三萜皂苷類化合物共鑒定出5個，下面以化合物47為例，簡述其鑒定過程：化合物47保留時間為11.91 min，準分子離子m/z 871.454 5[M+HCOO]-;以m/z 871.454 5 [M+HCOO]-為母離子進行MS/MS掃描，主要產生2個碎片離子，即m/z 697.418 2[M-COCH3-C4H8O2]-，m/z 667.167 8[M-H-OCOCH3- C5H10O2]-。結合文獻[17]報道，可將其鑒定為黃芪皂苷Ⅱ。化合物47的MS/MS圖見圖7。

3.5 醛類、酮類及其他類化合物的鑒定

應用提取離子色譜法結合UNIFI數據分析平臺，在ESI+、ESI-檢測模式下，推斷出5個醛類，2個酮類及其他類成分（包括1個醌類、1個聚炔類、1個單萜類化合物），其鑒定過程同上（不再一一列出）。

4 討論

在本研究中，筆者首次運用 UPLC-Q-TOF/MS技術結合UNIFI數據分析平臺定性分析了ZTHZC中的化學成分。UPLC能夠對各成分進行高效地分離，Q-TOF- MS具有高靈敏度、高分辨率，能夠進行精準檢測，Q-TOF/MS的MS數據采集模式可通過低碰撞能掃描和高碰撞能掃描之間快速切換同時完成兩種掃描功能的數據采集，排除假陽性結果，同時進行母離子、子離子、中性缺失分析。在低碰撞能掃描下得到相關分子離子峰及其加合峰的信息，在高碰撞能掃描下得到相關碎片峰的信息，兩者再通過保留時間進行關聯，UNIFI能夠進行快速篩查鑒定，將三者結合，即可實現快速地分離、檢測、鑒定ZTHZC的化學成分。本研究共鑒定了70個化學成分，包括38個有機酸及有機酸酯類、8個生物堿類、9個黃酮類、5個三萜皂苷類、5個醛類、2個酮類、1個醌類、1個聚炔類和1個單萜類化合物。2015年版《中國藥典》（一部）規定，利用薄層色譜法進行丹參鑒別和采用高效液相色譜法測定丹參素的含量來控制止痛化癥膠囊的質量[1]，但是對于中藥大復方，單一的成分含量測定不足以反映藥品的整體質量。而本研究檢測到的丹酚酸B等酚酸類、延胡索乙素等生物堿類及黃芪甲苷等都可作為質量控制標準，可保障藥品更加有效、安全。本研究為中藥材及中藥復方化學成分的分析提供了一種快速檢測的方法，同時也為ZTHZC的質量控制、藥效物質基礎的闡明提供了科學依據。

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（收稿日期：2019-04-02 修回日期：2019-05-20）

（編輯：林 靜）