基于聚類分析和主成分分析的壯瑤藥三妹木HPLC指紋圖譜研究

傅靜 張瑩 李宇輝 王孝勛

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）17-2355-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.10

摘 要 目的：建立壯瑤藥三妹木的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為不同產地三妹木的質量評價提供依據。方法：以廣西南寧、桂林、梧州等5不同產地的10批三妹木為樣品，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）軟件建立HPLC指紋圖譜并進行相似度評價[色譜柱為Inertsil ODS-3，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為350 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL]，通過對照品比對對共有峰進行指認。采用IBM SPSS 21.0軟件對其進行聚類分析和主成分分析。結果：建立了HPLC指紋圖譜，共確定了12個共有峰，并指認了其中3個共有峰（8、10、11號共有峰分別為夏佛塔苷、牡荊素和異牡荊素）;10批樣品的相似度均大于0.9。經聚類分析發現，10批藥材可聚為二大類;經主成分分析發現，2個主成分因子的累計方差貢獻率為86.108%（第一主成分、第二主成分的貢獻率分別為66.891%、19.217%）。結論：成功建立了三妹木藥材的HPLC指紋圖譜，該方法簡單、易行，為三妹木的質量控制提供了可靠的評價方法。

關鍵詞 壯瑤藥;三妹木;高效液相色譜法;化學計量學;指紋圖譜

Study on HPLC Fingerprints of Zhuang and Yao Medicine Lespedeza formosa Based on Cluster Analysis and Principal Component Analysis

FU Jing，ZHANG Ying，LI Yuhui，WANG Xiaoxun（School of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Zhuang and Yao medicine Lespedeza formosa， and to provide reference for quality control of L. formosa from different producing areas. METHODS： Totally 10 batches of samples were collected from 5 producing areas as Guangxi Nanning， Guilin， Wuzhou and so on. HPLC fingerprints was established and similarity analysis was carried out by using “Similarity evaluation system of TCM chromatographic fingerprint” （2012 edition） software. The determination was performed on Inertsil ODS-3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelength was set at 350 nm， and the column temperature was 35 ℃. The sample size was 10 μL. Common peaks were identified by comparing substance control. Cluster analysis and principal compoent analysis were performed by using IBM SPSS 21.0 statistical software. RESULTS： HPLC fingerprint was established， and 12 common peaks were calibrated. 3 common peaks were identified （common peak 8， 10， 11 were chafotalin， vitexin and isovitexin）. The similarity of 10 batches of samples were all higher than 0.9. Through cluster analysis， 10 batches of medicinal materials could be clutered into 2 groups. According to the principal component analysis， the cumulative variance contribution rate of the two principal component factors was 86.108% （contribution rates of first principal components and second principal components were 66.891% and 19.217%）. CONCLUSIONS： HPLC fingerprint of L. formosa is established successfully. The method is simple and easy to use， provides a reliable evalution method for quality control of L. formosa.

KEYWORDS ? Zhuang and Yao medicine; Lespedeza formosa; HPLC; Chemometrics; Fingerprint

三妹木來源于豆科植物美麗胡枝子[Lespedeza formosa （Vog.） Koehne.]的干燥莖葉，亦稱謀見亮、把天門、夜關門，為廣西壯族和瑤族地區民間常用中草藥[1-2]。其味苦，性平，具有清熱、利尿通淋之功，主治熱淋、小便不利[3]。壯醫認為三妹木具有調氣道、利水道、清熱毒、除濕毒、消腫痛的功效，主治肺癰、風濕骨痛、跌打損傷[4]。目前，關于三妹木的研究主要是在總黃酮的含量測定、體細胞染色體核型分析、種子萌發、幼苗生長規律等[5-8]方面，對其質量評價方面研究甚少。中藥指紋圖譜數據庫的研究和建立是中藥質量評價的重要發展趨勢之一，已成為中藥鑒定的一個重要平臺。且中藥指紋圖譜的構建方法及解析方法多種多樣，能全面反映中藥的整體化學特征，體現其內在的整體質量，是一種較為合理的中藥質量控制模式[9]。為促進廣西本土藥材資源的合理開發利用，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法結合化學計量學對廣西5個不同產地10批三妹木進行指紋圖譜研究，旨在為其質量評價提供依據。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀（包括四元泵洗脫系統、在線真空脫氣機、標準自動進樣器、智能化柱溫箱和光電二極管陣列檢測器）購自美國Waters公司;TGL-16B型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）;BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）;HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）;DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;As7240BT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）;DP5系列超純水儀（法國密里博公司）。

1.2 藥品與試劑

共采集三妹木藥材10批，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定均為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子L. formosa（Vog.）Koehne.的莖葉;夏佛塔苷對照品（上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：5861，純度：99.4%）;牡荊素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111687- 201704，純度：94.9%）;異牡荊素對照品（云南西力生物技術股份有限公司，批號：BBP00949，純度：97%）;甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher公司）;其他試劑均為分析純，水為超純水。三妹木藥材基源信息見表1。

表1 三妹木藥材基源信息

Tab 1 Material source information of L. formosa

[藥材批次＼&采收時間＼&藥材產地＼& ? ? ?經緯度＼&S1＼&2018-04-10＼&廣西南寧市邕寧區＼&N22.0° E108.0°＼&S2＼&2018-06-05＼&廣西來賓市金秀縣＼&N23.0° E110.0°＼&S3＼&2018-07-07＼&廣西梧州市藤縣＼&N24.0° E110.6°＼&S4＼&;2018-07-08＼&廣西來賓市象州縣＼&N23.6° E110.1°＼&S5＼&2018-07-11＼&廣西桂林市臨桂縣＼&N24.0° E110.2°＼&S6＼&2018-09-03＼&廣西柳州市三江縣＼&N25.0° E109.0°＼&S7＼&2018-09-15＼&廣西來賓市金秀縣＼&N23.9° E110.2°＼&S8＼&2018-10-20＼&廣西南寧市邕寧區＼&N22.0° E108.0°＼&S9＼&2018-11-03＼&廣西柳州市三江縣＼&N25.0° E109.0°＼&S10＼&2018-12-05＼&廣西來賓市金秀縣＼&N24.0° E110.2°＼&]

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別稱取夏佛塔苷對照品1.82 mg、牡荊素對照品1.34 mg、異牡荊素對照品1.54 mg，用75%乙醇溶解并定容至同一10 mL量瓶中，搖勻，制成含0.182 mg/mL夏佛塔苷、0.134 mg/mL牡荊素和0.154 mg/mL異牡荊素的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取批次為S2的藥材粉末2 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入75%乙醇20 mL，稱定質量，超聲（功率：500 W，頻率：35 kHz）提取30 min，冷卻至室溫，再次稱定質量，然后用75%乙醇補足減失的質量，濾過，續濾液以13 000 r/min離心10 min，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測器：光電二極管陣列檢測器;流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%→17%A;20～30 min，17%A;30～45 min，17%→21%A;45～55 min，21%→23%A;55～70 min，23%→50%A）;流速：0.8 mL/min;檢測波長：350 nm;柱溫：35 ℃;進樣量：10 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 稱取三妹木藥材粉末（批次為S2）2 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜。以夏佛塔苷峰（8號峰）為參照峰，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD在0.03%～0.19%之間（n=6），相對峰面積的RSD在0.03%～0.30%之間（n=6），表明檢測儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 分別稱取同一批三妹木藥材粉末（批次為S2）2 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜。以夏佛塔苷峰（8號峰）為參照峰，分別考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD在0.12%～1.18%之間（n=6），相對峰面積的RSD在0.10%～1.27%之間（n=6），表明本方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 稱取三妹木藥材粉末（批號為S2）2 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備0、4、8、10、12、24 h后按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜。以夏佛塔苷峰（8號峰）為參照峰，分別考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD在0.07%～2.13%之間（n=6），相對峰面積的RSD在0.11%～2.44%之間（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評價、共有峰的相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 稱取10批三妹木藥材粉末，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜。將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）軟件中，以S9號色譜圖為參照圖譜，將時間窗寬度設為0.2，采用多點校正法進行色譜峰匹配，選擇中位數法生成對照圖譜R[10-12]。對照指紋圖譜R見圖1，10批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜見圖2。

2.4.2 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”軟件，以藥材樣品HPLC對照圖譜R為參照，進行整體相似度評價。結果顯示，10批藥材樣品相似度在0.901～0.995之間，表明不同批次藥材樣品間差異較小。相似度評價結果見表2。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 確定共有峰12個，通過與對照品溶液色譜峰比對（取“2.1.1”項下混合對照品溶液按“2.2”項下色譜條件測定，記錄色譜圖），確認8、10、11號共有峰分別為夏佛塔苷、牡荊素和異牡荊素。其中8號峰峰面積較大，分離度及對稱因子均符合要求，且為所有藥材樣品共有，故設定其為參照峰（S），計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積?；旌蠈φ掌啡芤旱纳V圖見圖3，10批藥材樣品相對保留時間、相對峰面積的測定結果分別見表3、表4。

2.5 化學計量學分析

2.5.1 聚類分析 以12個共有峰的峰面積為原始數據，運用IBM SPSS 21.0 軟件對10批三妹木藥材進行聚類分析，采用組間平均數聯結法，以Euclidean平方距離為度量標準[12-14] 。結果顯示，10批三妹木藥材樣品可聚為二大類：批次為S2、S3、S4、S5、S7、S10的聚為一類，批次為S1、S6、S8、S9的聚為另一類。三妹木樣品聚類分析樹狀圖見圖4。

2.5.2 主成分分析 用IBM SPSS 21.0 軟件對10批次廣西不同產地三妹木藥材的12個變量（共有峰峰面積）進行標準化處理，以主成分的方差貢獻率及特征值為依據，進行主成分分析，計算相關系數矩陣、主成分特征值、方差貢獻率以及主成分綜合得分，對各產地的三妹木藥材進行評價[15]。

根據各因子特征值大于1及因子的方差累計貢獻率大于85%的原則作為主成分提取的標準，本研究需提取的主成分主要有2個：第一主成分的特征值為8.198，其貢獻率為66.891%;第二主成分的特征值為2.135，其貢獻率為19.217%。這2個主成分的累計方差總貢獻率為86.108%。以主成分因子為變量繪制公因子碎石圖，可以看出特征值較高的2個主成分的斜率更大，說明前2個主成分可以最大程度地反映三妹木藥材的品質關系，可見提取前2個主成分進行分析較為適宜。公因子碎石圖見圖5。

為了使提取的主成分更加全面、清晰地反映原始數據包含的信息，將因子分析得到的成分矩陣進行正交旋轉，得到12個指標在2個主成分中的旋轉矩陣。結果顯示，第一主成分的信息主要來自于色譜峰2、3、4、6、8（夏佛塔苷），此類峰的峰面積較大，表示成分含量較高，對三妹木品質有明顯的影響;第二主成分的信息主要來自于色譜峰10（牡荊素）、11（異牡荊素）。初始因子荷載矩陣見表5。

10批次三妹木樣品有規律地分布為二大類，即批次為S2、S3、S4、S5、S7、S10的聚為一類，批次為S1、S6、S8、S9的聚為另一類，該結果與聚類分析結果一致。 主成分得分圖見圖6。

2.5.3 基于主成分分析建立廣西產三妹木質量評價綜合模型 根據表5結果，以X1、X2代表2個主成分來作為10批三妹木樣品成分所表達的信息，以其共有峰峰面積為變量，建立其品質評價模型。得到第一主成分的線性關系表達式為：X1=0.834共有峰1+0.925共有峰2+ 0.917共有峰3+0.911共有峰4+0.887共有峰5+0.942共有峰6+0.888共有峰7+0.961共有峰8+0.881共有峰9 ?-0.018共有峰10-0.109共有峰11+0.795共有峰12;第二主成分的線性關系表達式為：X2=-0.38共有峰1-0.28共有峰2+0.186共有峰3+0.07共有峰4-0.318共有峰5-0.222共有峰6+0.072共有峰7-0.27共有峰8-0.145共有峰9+0.957共有峰10+0.868共有峰11+0.344共有峰12（注：表達式中各變量非原始峰面積，而是標準化處理后峰面積）。將上述表達式與所對應的的2個主成分的方差貢獻率作內積后，得到三妹木質量綜合評價函數X（綜合得分）的表達式為：X（綜合得分）=（68.313X1+19.217X2）/86.108，綜合得分越高表示藥材樣品的整體質量越好[16]。結果顯示，批次為S2、S3、S4、 S5、S7的樣品的綜合得分均>0，且以S2樣品綜合得分最高。不同產地三妹木藥材的主成分得分、綜合得分及排名情況見表6。

3 討論

在前期研究中，筆者對樣品的提取方法（超聲、加熱回流和冷浸法）、提取溶劑（不同體積分數的甲醇、乙醇和水）等進行了考察，最終采用75%乙醇超聲提取作為樣品前處理方法。另外，筆者還對不同流動相體系（甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸）以及不同檢驗波長（260、300、350、380 nm）等HPLC色譜條件進行了優選。最終確定采用Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為350 nm。在該色譜條件下，HPLC特征指紋圖譜基線平穩，色譜峰較多且分離度較好。

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）軟件進行相似度分析，發現10批三妹木藥材樣品相似度均>0.9，表明藥材樣品質量穩定，差異較小。在12個共有峰中，通過與混合對照品溶液HPLC色譜圖比對，指認出了夏佛塔苷、牡荊素和異牡荊素峰。各共有峰相對保留時間的RSD差異較小，但相對峰面積的RSD差異較大，說明不同產地三妹木藥材中的成分類型一致，但含量有較大差異。這可能與三妹木藥材的生長環境、采收季節等因素有關。

利用化學模式識別法中的聚類分析與主成分分析相結合，對不同產地的三妹木樣品進行聚類鑒別和判別分析。聚類分析是在“相似度”的基礎上對樣品進行歸類，反映樣品之間的穩定性。主成分分析則是對樣品信息的濃縮，利用方差最大原則，對降維后的多變量重新組合成幾個新的主分量，并盡可能多地保留原始變量的信息，通過得分圖對樣品進行分類。在聚類分析中，將10批三妹木藥材樣品聚為二大類，其中批次為S2、S3、S4、S5、S7、S10的聚為一類，編號為S1、S6、S8、S9的聚為另一類，與主成分得分結果一致。第一主成分的信息主要來自于色譜峰2、3、4、6、8（夏佛塔苷）;第二主成分的信息主要來自于色譜峰9（牡荊素）、10（異牡荊素）。綜合得分大于0的藥材的產地有來賓市金秀瑤族自治縣、梧州市藤縣、來賓市象州縣和桂林市臨桂縣，批次為S2、S4、S7、S10的樣品均采自來賓市金秀瑤族自治縣，但批次為S2的樣品綜合得分最高（得分越高質量越好），這說明藥材質量不僅與產地有關，還受采收時間、溫度、土壤、降雨量及不同植株年份累積的影響。

在本研究中，建立的方法可對三妹木藥材進行整體性的評價，可為其質量控制提供一定的理論依據。由于中藥材質量受多方面因素的影響，不同產地間的質量存在較大差異，利用主成分分析能篩選出共有的特征成分，并指導發現主要成分，但中藥化學成分復雜，其他可作為質量評價的成分還未知，故下一步筆者將通過液質聯用等分析技術，確定其他未知共有峰所代表的化合物，對三妹木藥材進行進一步研究。

參考文獻

[ 1 ] 覃迅云，羅金裕，高志剛.中國瑤藥學[M].北京：民族出版社，2002：918-920.

[ 2 ] 滕紅麗，梅之南.中國壯藥資源名錄[M].北京：中醫古籍出版社，2014：128.

[ 3 ] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第四冊[M].上海：上?？萍汲霭嫔纾?999：544-546.

[ 4 ] 朱華，田慧，蔡毅.壯藥學[M].南寧：廣西科學技術出版社，2015：102.

[ 5 ] 胡文波，石森林，高敏，等.美麗胡枝子不同部位總黃酮含量測定[J].中國現代應用藥學，2008，25（6）：542-544.

[ 6 ] 劉慶華，王奎玲，王瑋，等.美麗胡枝子核型分析[J].西北植物學報，2009，29（8）：1595-1598.

[ 7 ] 胡冬南，徐榮華，李萍球.美麗胡枝子多倍體誘導的初步研究[J].江西農業大學學報，2007，29（1）：81-84.

[ 8 ] 田宏，王志勇，張鶴山，等.不同溫度下美麗胡枝子種子的發芽特性[J].種子，2017，36（7）：73-75.

[ 9 ] 李強，李超.中藥指紋圖譜研究綜述[J].齊魯藥事，2010，29（3）：158-161.

[10] 周欣，張琳，毛嬋，等.基于化學計量學方法結合正交偏最小二乘判別分析的陳皮飲片HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2019，50（9）：2194-2200.

[11] 靳貝貝，裴香萍，梁惠珍.青皮藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析[J].中國藥房，2018，29（24）：3336-3339.

[12] 馮華，王祥培，王世俊，等.辣椒藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析[J].中國藥房，2019，30（8）：1078-1082.

[13] 劉金亮，李隆云，何光華，等. HPLC指紋圖譜結合化學計量學與抗氧化能力評價不同產地槐米的品質[J].中草藥，2018，49（19）：4644-4652.

[14] 嚴寶飛，朱邵晴，宿樹蘭，等.不同產地黃芩莖葉UPLC指紋圖譜與化學模式識別研究[J].南京中醫藥大學學報，2017，33（6）：633-638.

[15] 朱星宇，陳勇強. SPSS多元統計分析方法及應用[M].北京：清華大學出版社，2005：241-247.

[16] JAYARAMANN U，GUPTA AK. An efficient minutiae based geometric hashing for fingerprint database[J]. Neurocomputing，2014，137（5）：115-126.

（收稿日期：2019-04-04 修回日期：2019-07-01）

（編輯：林 靜）