牡丹皮炒炭前后顏色與有效成分含量的相關性分析

陳昕 黃茂勝 孟江 王淑美

中圖分類號 R283 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）17-2360-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.11

摘 要 目的：研究牡丹皮炒炭前后顏色與有效成分含量的相關性，為牡丹皮和牡丹皮炭飲片的鑒別和質量評價提供參考。方法：使用色差儀測定牡丹皮炒炭前后飲片粉末顏色的色度空間參數[明度值（L*）、紅綠分量值（a*）、黃藍分量值（b*）及總色差值（E*ab）]，采用高效液相色譜法測定牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末中10種有效成分（沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）的含量，并應用SPSS 21.0軟件對顏色的色度空間參數和有效成分含量進行相關性分析。結果：沒食子酸含量與色度空間參數均無相關性（P>0.05）;5-羥甲基糠醛含量與L*、b*、E*ab呈極顯著性負相關（P<0.01），與a*呈極顯著性正相關（P<0.01）;芍藥苷含量與L*、b*、E*ab呈極顯著性正相關（P<0.01），與a*無相關性（P>0.05）;氧化芍藥苷含量與L*、E*ab呈極顯著性正相關（P<0.01），與a*呈極顯著性負相關（P<0.01），與b*無相關性（P>0.05）;兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素含量與L*、b*、E*ab均呈顯著性正相關（P<0.05），與a*呈顯著性負相關（P<0.05）。結論：色差技術可以量化牡丹皮和牡丹皮炭飲片的顏色，牡丹皮炒炭前后顏色與其有效成分含量具有顯著的相關性。

關鍵詞 牡丹皮;牡丹皮炭;含量;顏色;相關性分析

Correlation Analysis of Color and Effective Components Content in Moutan Cortex before and after Carbonized

CHEN Xin，HUANG Maosheng，MENG Jiang，WANG Shumei（School of TCM， Guangdong Pharmaceutical University/Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica， State Administration of Traditional Chinese Medicine/Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of Universities in Guangdong Province， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the correlation between the color of Moutan Cortex and the contents of effective components before and after carbonized， and to provide reference for identification and quality evaluation of Moutan Cortex and its charcoal piece decoction. METHODS： Using colorimeter determination of Moutan Cortex and Moutan Cortex charcoal decoction pieces powder chroma space parameter [lightness value （L*）， red， green and component values （a*）， yellow and blue component value （b*） and total color difference value （E*ab）]， HPLC method for content determination of 10 effective components （gallic acid， 5-HMF， catechins， oxypaeoniflorin， paeoniflorin， quercetin， benzoyl paeoniflorin， isorhamnetin， paeonol， kaempferide） content in Moutan Cortex and Moutan Cortex charcoal decoction pieces. On this basis， the correlation between the content of effective components and the chromaticity space parameter of a color was studied by SPSS 21.0 software. RESULTS： There was no correlation between gallic acid content and the chromaticity space parameter of a color （P>0.05）. There was an extremely significant negative correlation between 5-HMF content and L*， b*， E*ab （P<0.01）， and an extremely significant positive correlation between 5-HMF content and a* （P<0.01）. The content of paeoniflorin was positively correlated with L*， b* and E*ab， but not with a* （P>0.05）. The content of oxidized paeoniflorin was positively correlated with L* and E*ab （P<0.01）， and negatively correlated with a* （P<0.01）， but not with b* （P>0.05）. The content of catechins， quercetin， benzoyl paeoniflorin， isorhamnin， paeonol and kaempferol were positively correlated with L*， b* and E*ab （P>0.05）， and negatively correlated with a* （P>0.05）. CONCLUSIONS： Chromatic aberration technology can quantify the color of Moutan Cortex and its charcoal decoction pieces， and there is a significant correlation between the color of Moutan Cortex before and after processing and the content of its active ingredients.

KEYWORDS Moutan Cortex; Moutan Cortex charcoal; Content; Color; Correlation analysis

牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，味苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經，具有清熱涼血、活血化瘀的功效，用于熱入營血、溫毒發斑、吐血衄血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經閉痛經、跌撲傷痛、癰腫瘡毒等癥[1]。牡丹皮炭為牡丹皮的炒炭品，具有涼血止血的作用，用于吐血、崩漏及多種血熱出血證[2]。研究發現，牡丹皮及牡丹皮炭飲片中均含有酚及酚苷類成分（如丹皮酚）、單萜及其苷類成分（如芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷）和其他成分[如5-羥甲基糠醛（5-HMF）、沒食子酸、兒茶素、槲皮素、山柰素、異鼠李素]等多種有效成分[3-6]，且這些有效成分具有解熱、活血化瘀、收斂止血、抑制血小板聚集等功效[7-10]，與牡丹皮及牡丹皮炭飲片的功效一致。2015年版《中國藥典》（一部）[1]中關于牡丹皮炮制前后的質量控制，主要是通過傳統經驗鑒別外觀性狀、顏色和丹皮酚含量測定相結合的方法。但顏色評價具有很大的主觀性和模糊性，而飲片顏色差異常常反映其質量優劣，且與飲片內在物質成分含量的高低也息息相關[11-12]。目前，牡丹皮和牡丹皮炭飲片成分和顏色之間的相關性尚未見報道，故有必要對牡丹皮炒炭前后顏色進行客觀、數字化評價，并對顏色和成分之間的相關性進行分析。

色彩色差計又稱為光電反射光度計，其可以用光電測定的方法，迅速、準確、方便地測出各種試樣被測位置的顏色，并且通過計算機直接換算成明度值（L*）、紅綠分量值（a*）、黃藍分量值（b*）對顏色進行數值化表示[13]。近年來，色差分析在食品、藥品方面應用較多，如萬超等[14]采用色差計測定醋延胡索飲片顏色并與主要成分含量進行相關性分析，實現了醋延胡索質量的快捷評價;徐珍珍等[12]利用色差計對木香粉末的色差值進行測定并與有效成分木香烴內酯、去氫木香內酯和揮發油的含量相關聯，為木香質量評價體系的建立提供了參考。因此，本研究采用色差計對牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末進行顏色的測定，將傳統的顏色指標進行客觀化和數字化，并與其有效成分（沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）含量進行相關性研究，為牡丹皮和牡丹皮炭飲片的鑒別和質量評價提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

CR-400/410色彩色差計、CR-A50粉末測試盒、CR-A33e玻璃防光保護盒（日本柯尼卡美能達有限公司）;1100系列高效液相色譜（HPLC）系統，配備一個光電二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）;CY-20炒藥機（江陰市祝塘明科機械廠）;JP-105A高速多功能粉碎機（永康市久品工貿有限公司）。

1.2 藥品與試劑

10批牡丹皮藥材分別購買于10個不同地區，由廣東藥科大學中藥學院劉基柱教授鑒定均為毛茛科植物牡丹P. suffruticosa Andr.的干燥根皮，藥材收集后裝入密封袋存放于干燥器中陰涼避光處保存，并于3年內完成試驗;兒茶素對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-12050702，純度：≥98%）;山柰素對照品（批號：110861-201310，純度：≥98%）、異鼠李素對照品（批號：110860-201410，純度：≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;5-HMF對照品（批號：150802，純度：≥98%）、沒食子酸對照品（批號：140801，純度：≥98%）、氧化芍藥苷對照品（批號：150822，純度：≥98%）、芍藥苷對照品（批號：150609，純度：≥98%）、槲皮素對照品（批號：140425，純度：≥98%）和苯甲酰芍藥苷對照品（批號：150903，純度：≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;丹皮酚對照品（本實驗室自制，批號：20150708，純度：≥98%）;乙腈和甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。牡丹皮藥材來源見表1。

2 方法與結果

2.1 牡丹皮和牡丹皮炭樣品的制備

2.1.1 牡丹皮飲片樣品的制備 取牡丹皮藥材，迅速洗凈，潤后切薄片，曬干，粉碎過5號篩，即得。

2.1.2 牡丹皮炭飲片樣品的制備 分別取一半的各批次牡丹皮樣品，照2015年版《中國藥典》（四部）通則0213中炒炭法[15]，并結合課題組前期優選的炮制工藝[16]炒至樣品表面呈黑褐色，內部黃褐色。取出，晾涼，粉碎過5號篩，即得（對應飲片樣品編號為PMC-01～PMC-10）。

2.2 牡丹皮炒炭前后顏色的色度空間參數測定

采用色彩色差計分別對牡丹皮樣品和牡丹皮炭粉末進行客觀評價。每批樣品測定5次，取平均數。測定條件為光源D65，標準觀察角度2°，照明口徑50 mm，儀器誤差（ΔE*ab）在0.8以內，重復性標準偏差（ΔE*ab）在0.07以內，以色度空間參數L*、a*、b*進行色澤量化，總色差值（E*ab）=[（L*）2+（a*）2+（b*）2]1/2。

2.2.1 精密度考察 取樣品RMC-01適量，在同一時間點測量顏色的色度空間參數，重復測量5次，取平均值。結果，L*、a*、b*的RSD分別為0.07%、0.67%和0.14%（n=5），表明儀器精密良好。

2.2.2 在不同界光亮強度下的穩定性考察 取樣品RMC-01適量，置于同一裝載容器內，分別在同一天的不同時間點（8 ∶ 30、11 ∶ 30、14 ∶ 30、17 ∶ 30、20 ∶ 30）測量顏色的色度空間參數，每個時間點重復測量5次，取平均值。結果，L*、a*、b*的RSD分別為0.92%、2.73%和2.01%（n=5），表明外界光強度對試驗結果影響較小。

2.2.3 樣品穩定性考察 取樣品RMC-01適量，置于同一裝載容器內，分別放置0、1、2、3、4、5 d后測量顏色的色度空間參數，每次重復測量5次，取平均值。結果，L*、a*、b*的RSD分別為1.14%、2.76%和2.21%（n=5），表明樣品5 d內穩定性良好。

2.2.4 牡丹皮及牡丹皮炭飲片顏色的色度空間參數測定 分別取10批牡丹皮和牡丹皮炭飲片，按 “2.2”項下方法操作，測定各樣品顏色的色度空間參數，結果見表2。

2.2.5 牡丹皮和牡丹皮炭顏色差異性分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，采用SPSS 21.0軟件進行相關分析。由于測得的牡丹皮和牡丹皮炭顏色的色度空間參數數據不完全符合多元正態性和方差齊性分布，故選擇KruskaWallis H秩和檢驗進行分析。以牡丹皮和牡丹皮炭分類作為分組變量，牡丹皮和牡丹皮炭的L*、a*、b*為檢驗變量，經KruskaWallis H檢驗發現，牡丹皮和牡丹皮炭L*、a*、b*的χ2值分別為14.286、9.143、13.166（P均<0.01），拒絕H0，接受H1，可認為二者間顏色有顯著性差異。

2.2.6 牡丹皮和牡丹皮炭顏色判別分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為分組變量，測得的牡丹皮和牡丹皮炭顏色的色度空間參數為自變量，并且作為訓練集樣本。采用SPSS 21.0軟件建立以L*、a*、b*為輸入的判別兩組的判別函數。再用訓練集樣本回代[17-18]，對判別函數進行驗證。由組間均值相等性檢驗結果可知，自變量L*、a*、b*的P均<0.01，表明在判別函數中L*、a*、b*均有統計學意義，L*、a*、b*的λ值（反映組間差異程度，λ值越接近0，組間差異越顯著）分別為0.092、0.603、0.364，其中L*的λ值最接近0，故可認為L*判別更有意義。由Wilk’s Lambda檢驗結果建立了典型判別函數，λ值為0.045，P=0，判別函數有統計學意義，標準化典型判別函數=2.794×L*+2.839×a*-1.421×b*，非標準化典型判別函數=0.987×L*+3.816×a*-1.575×b*-49.308。將樣本數據代入非標準化典型判別函數，得到各樣本的函數值，函數值大于0的樣本，判到“牡丹皮”，反之判到“牡丹皮炭”。Fisher的線性判別式函數分別為牡丹皮=71.904×L*+334.979×a*-159.175×b*-1 895.500，牡丹皮炭=63.282×L*+301.656×a*-145.960×b*-1 464.970，將樣本數據代入兩個線性判別式函數中，得出兩個函數值，將樣本判入所得函數值較大的分組中。

2.3 多成分含量測定

2.3.1 樣品溶液的制備 準確稱量樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，室溫超聲（功率：300 W，頻率：50 kHz）提取30 min，然后以20 000 ? ? ?r/min離心10 min，取上清液轉移至100 mL量瓶中，加50%甲醇定容并搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2 色譜條件 參考本課題組前期測定牡丹皮炮制前后化學成分（沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）含量的條件和方法[9]，色譜條件如下：色譜柱為Ultimate TM XB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）;流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）（V/V），梯度洗脫（0～30 min，5%→15%A;30～60 min，15%→50%A;60～70 min，50%→95%A）;檢測波長為254 nm;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL/min;進樣量為10 μL。

2.3.3 方法學考察 按照相關方法進行方法學考察。結果顯示，10個成分的標準曲線方程的相關系數R2均>0.999 1;檢測限和定量限范圍分別為2.4～37.5 ng和0.011～0.258 2 μg;在精密度試驗中，日內、日間的RSD分別為0.16%～1.97%、0.39%～2.06%（n=6）;在穩定性試驗中，峰面積的RSD均<3.0%（n=6）;平均回收率為91.8%～109.5%，RSD均<5.0%（n=6）。結果表明，該方法準確、可行。

2.3.4 牡丹皮及牡丹皮炭飲片中10個有效成分含量的測定 取牡丹皮和牡丹皮炭飲片，按“2.3.1” 項下方法制成樣品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，并計算各成分的含量，每個樣品重復測定3次，結果見表3。

2.4 相關性分析

2.4.1 顏色與牡丹皮炒炭前后的Pearson相關性分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為自變量，L*、a*、b*、E*ab為因變量，利用SPSS 21.0軟件對其進行Pearson相關性檢驗。結果，組別與L*、a*、b*、E*ab的相關性系數分別為-0.953、0.630、-0.797、-0.955，雙側P均<0.05，可認為牡丹皮炒炭前后與L*、b*、E*ab呈顯著性負相關，而與a*則呈顯著性正相關。

2.4.2 顏色與有效成分含量的Pearson相關性分析 利用SPSS 21.0軟件對牡丹皮和牡丹皮炭飲片中10個有效成分的含量與其色度空間參數L*、a*、b*、E*ab進行Pearson相關性分析，結果見表4。

從表4可以看出，牡丹皮和牡丹皮炭飲片中除了沒食子酸外，其他成分含量均與顏色的色度空間參數有顯著相關性。其中，兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚和山柰素含量與L*、b*、E*ab存在顯著性正相關關系，與a*存在顯著性負相關關系;5-HMF含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性負相關關系，與a*存在極顯著性正相關關系;芍藥苷含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性正相關關系，與a*無相關性;氧化芍藥苷含量與L*、E*ab存在極顯著性正相關關系，與a*存在極顯著性負相關關系，與b*無相關性。

2.4.3 顏色與有效成分含量的線性回歸分析 以牡丹皮和牡丹皮炭飲片中10種有效成分含量為自變量，色度空間參數L*、a*、b*、E*ab為因變量，利用SPSS 21.0軟件進行線性回歸分析。結果，自變量與顏色的色度空間參數L*、a*、b*和E*ab的決定系數R2分別為0.919、0.663、0.949、0.922，說明顏色的色度空間參數受有效成分含量的影響程度分別為91.9%、66.3%、94.9%、92.2%，這表明牡丹皮和牡丹皮炭飲片的顏色與有效成分含量的相關性較大，即10種有效成分含量可以解釋顏色色度空間參數的66.3%～94.9%，結果見表5。

2.4.4 牡丹皮炒炭前后與有效成分含量的相關性 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為自變量， 10個有效成分含量為因變量，采用SPSS 21.0軟件對其進行Pearson相關性分析。結果顯示，牡丹皮炒炭前后與10個有效成分（沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）的相關系數r分別為0.328（P>0.05）、0.859（P<0.01）、-0.742（P<0.01）、-0.751（P<0.01）、-0.788（P<0.01）、-0.979（P<0.01）、-0.974（P<0.01）、-0.910（P<0.01）、-0.819（P<0.01）、-0.898（P<0.01）。由r值可以看出，10個成分中除了沒食子酸外，其他成分的含量與牡丹皮炒炭前后均具有顯著相關性，其中5-HMF含量呈顯著性正相關，其余8個成分（兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）均呈顯著負相關。

3 討論

本研究通過對牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末的顏色色度空間參數進行測定和分析，發現牡丹皮炒炭前后與色度空間參數L*、a*、b*、E*ab均有顯著相關性，與L*、b*、E*ab呈顯著性負相關，與a*則呈顯著性正相關。將牡丹皮炒炭前后顏色色度空間參數與其主要有效成分的含量進行相關性分析，發現除5-HMF含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性負相關關系，與a*存在極顯著性正相關關系外;其他絕大多數成分（兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素）含量均與L*、b*、E*ab存在顯著性正相關關系，與a*存在顯著性負相關關系。以上結果說明，可以通過飲片顏色區分牡丹皮的不同炮制品，同時牡丹皮不同炮制品顏色與其藥效成分含量具有顯著的相關性。故利用色差計將主觀顏色進行數字化、精確化、客觀化，并結合HPLC法對多個有效成分含量測定，建立的牡丹皮飲片的顏色與多個有效成分含量之間的相關性評價技術，可快速、準確地判定牡丹皮和牡丹皮炭飲片質量，這不僅可為中藥材及飲片進行精確客觀的質量控制提供科學依據，也有利于規范中藥材及飲片流通使用中的質量控制，促進中藥材及飲片市場的良好發展。

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（收稿日期：2019-03-08 修回日期：2019-05-20）

（編輯：林 靜）