慢性不可預(yù)見性溫和性應(yīng)激對大鼠心肌損傷的影響

成文丈 薛慧英 孔繁曄 劉麗娜 于靜 孫夢晗

【摘要】目的：采用慢性溫和性不可預(yù)見性應(yīng)激建立大鼠抑郁模型觀察心肌組織中一氧化氮、一氧化氦合酶、C-反應(yīng)蛋白含量的變化，探討抑郁對心肌損傷的影響。方法：對SD大鼠成年期施予慢性溫和性應(yīng)激42天，建立抑郁模型，通過糖水偏好實驗、體重變化記錄行為學(xué)指標(biāo);應(yīng)用qRT-PCR方法檢測心肌組織中NOS、CPR mRNA含量，用Elisa方法檢測NO蛋白含量，進一步探討抑郁對心肌損傷的影響。結(jié)果：應(yīng)激組的體重增加量明顯低于對照組（p<0.05）;兩組間大鼠的飲糖水量及糖水偏好指數(shù)具有明顯差異（p<0.001）;雄性的體重增加量及糖水消耗量高于雌性（p<0.05）。應(yīng)激組的5-HTl A的含量低于對照組，應(yīng)激組的NOS、CRP、NO的含量高于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均<0.05。結(jié)論：慢性溫和性不可預(yù)見性應(yīng)激誘導(dǎo)NO、NOS、CRP的表達(dá)增加心肌損傷的風(fēng)險。

【關(guān)鍵詞】慢性溫和性不可預(yù)見性應(yīng)激，一氧化氦，一氧化氦合酶，C-反應(yīng)蛋白

[中圖分類號]R541 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）17-0010-02

抑郁癥作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronaryAtheroselerotic Heart Disease，CHD）的獨立危險因素，不但增加CHD的發(fā)病率，而且對CHD的預(yù)后產(chǎn)生不良影響，嚴(yán)重抑郁可使脂質(zhì)過氧化增加，血漿HNE和ADMA（4甲基-2-NONERAL和不對稱的二甲基精氨酸）水平顯著升高，血漿NO明顯減少，內(nèi)皮NOS產(chǎn)生減少，從而影響了血管收縮和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響了血流灌注，加重內(nèi)皮損傷，最終增加了冠心病風(fēng)險。但國內(nèi)研究者通過動物抑郁模型發(fā)現(xiàn)心肌中NO、NOS的表達(dá)含量的增加，引起心肌的損傷。二者之間的差異性分析需在本實驗研究中進一步的驗證。

1材料與方法

1.1實驗材料成年SD大鼠40只，購置，體質(zhì)量180～220克，雄性、雌性各20只，飼養(yǎng)條件：（23±2）℃，濕度50%±10%，自然光照（12 h/12 h），自由攝食飲水，雄鼠雌鼠分開飼養(yǎng)。適應(yīng)環(huán)境一周后，隨機分為實驗組和控制組，每組各10只。大鼠、鼠糧、墊料均由遼寧省長生生物技術(shù)股份有限公司提供。本實驗研究均符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則。

1.2實驗方法

1.2.1慢性不可預(yù)見性溫和性應(yīng)激（Chronic unpredictabilityofmild stress，CUMS）

具體的應(yīng)激方法包括：45°鼠籠傾斜，懸尾3min，濕籠，剝奪飲水或飼料，晝夜光照顛倒等。為避免動物適應(yīng)應(yīng)激，干擾應(yīng)激效果，所有的應(yīng)激方法均為隨機選定。期間，每周日上午10：00監(jiān)測小鼠體重變化。4周應(yīng)激結(jié)束后對小鼠進行糖水偏好實驗。造模結(jié)束后，先進行行為學(xué)測試，測試完成后麻醉大鼠，取各組大鼠心肌和海馬組織，備用。

1.2.2糖水偏好實驗評價大鼠快感缺失狀態(tài)實驗前先對大鼠進行糖水預(yù)適應(yīng)，將1%蔗糖水及清水置于大鼠籠上，使其適應(yīng)糖水味道。實驗前大鼠禁食禁水24h。實驗時將大鼠單獨置于干凈的籠內(nèi)，籠中放置事先稱質(zhì)量的糖水瓶及清水瓶各1瓶，0.5 h后交換兩瓶的位置，1 h后取走糖水瓶及清水瓶稱重，計算每只大鼠的糖水偏好情況，糖水偏好值=糖水飲用量/總液體飲用量×100%。

1.2.3用Qrt-pcr法檢測海馬內(nèi)5-HTlA、心肌內(nèi)NOS、CRP的mRNA含量先采用Trziol法提取Rna，使用HiScriⅡQSelect RT Super Mix for qPCR（+gDNA wiper）進行反轉(zhuǎn)錄，后用試劑ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。記錄循環(huán)閾值（cycle threshold，ct），通過△△Ct法來計算各個處理組相對于對照組的循環(huán)閾值倍數(shù)，從而衡量各組間mRNA表達(dá)的差異。引物設(shè)計如表1。（試劑及引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供）

1.2.4檢測NO蛋白含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定NO含量，所有步驟按說明書操作。測試完成后分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各組大鼠心肌組織中NO蛋白含量并進行統(tǒng)計分析。（試劑由海聯(lián)生物提供）

1.2.5統(tǒng)計方法統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計量數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間差異比較采用獨立樣本t檢驗。

2結(jié)果

2.1大鼠行為指標(biāo)變化CUMS結(jié)束后的體重與大鼠的最初體重的增加量方面，應(yīng)激組明顯低于對照組（p<0.05）。CUMS結(jié)束后檢測大鼠的飲糖水量及糖水偏好指數(shù)具有明顯差異。應(yīng)激組的糖水消耗量和偏好值明顯低于對照組。雄性的體重增加量及糖水消耗量高于雌性，但糖水偏好值低于雌性。詳見表2和表3。

2.2大鼠的心肌損傷指標(biāo)及5-HT表達(dá)含量的變化應(yīng)激組的5-HTlA的含量低于對照組，應(yīng)激組的NOS、CRP、NO的含量高于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

3討論

慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激是建立抑郁動物模型較理想的方法之一，能使大鼠出現(xiàn)典型的抑郁癥臨床癥狀，如：興趣喪失、反應(yīng)遲鈍、情緒低落、記憶力減退、體重減輕等。研究中應(yīng)激組的體重增加量明顯低于對照組，表明CUMS能誘導(dǎo)大鼠體重減輕。糖水偏好實驗可用于評估模型動物的快感缺失狀態(tài)，是衡量陜感缺乏的客觀指標(biāo)。本研究結(jié)果與吳紅芳的研究結(jié)果一致，應(yīng)激組與對照組比較具有明顯差異。研究表明，大鼠成年期遭受CUMS會出現(xiàn)抑郁癥狀，快感缺失。

下丘腦一垂體一腎上腺軸失調(diào)導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。當(dāng)機體受到應(yīng)激時，HPA軸調(diào)控釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，導(dǎo)致5-羥色胺及去甲腎上腺素合成不足，出現(xiàn)與抑郁癥相關(guān)的癥狀。抑郁模型的大鼠海馬區(qū)的代謝指標(biāo)亦會出現(xiàn)異常并呈一定規(guī)律性動態(tài)變化。研究中海馬的5-HT的減少與抑郁癥的發(fā)病機制有關(guān)。一氧化氮濃度增加，可能通過影響中樞5-HT、NE等神經(jīng)遞質(zhì)釋放并加重腦損傷而誘發(fā)抑郁癥狀。目前，在心血管方面有學(xué)者研究認(rèn)為持續(xù)產(chǎn)生合適濃度的NO有利于心肌的保護。但本研究中心肌組織的NO、NOS含量高于對照組。可能由于NOS在生理狀態(tài)下不表達(dá)，但可因內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子等激活，通過調(diào)控產(chǎn)生大量NO，釋放持續(xù)時間長達(dá)數(shù)小時至數(shù)日，超出機體代償范圍而表現(xiàn)出毒性作用，促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這提示人體內(nèi)NO的平衡具有十分重要的作用，一方面，持續(xù)產(chǎn)生適合范圍濃度的NO有利于保護心肌;另一方面，失衡會使NO成為心血管的損傷因素，高濃度的NO可能有促凋亡的作用。已有動物實驗證實上調(diào)心肌中NOS含量后心肌細(xì)胞凋亡增多，而給予NOS抑制劑治療后，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。

C-反應(yīng)蛋白與冠心病的發(fā)生、發(fā)展、危險度分層以及預(yù)后密切相關(guān)，因此CRP作為冠心病的影響因子之一，被認(rèn)為是預(yù)測未來心血管危險的重要炎癥標(biāo)記物，CRP還能抑制血管肉皮細(xì)胞分泌NO、介導(dǎo)血管平滑肌凋亡。提示慢性炎癥反應(yīng)可能是抑郁促發(fā)、加重冠心病的一個重要的病理生理機制。精神應(yīng)激或抑郁可能通過改變機體神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)，從而觸發(fā)或加重了內(nèi)皮的損傷以及隨后發(fā)生的炎癥過程，進而誘發(fā)、促使冠心病的產(chǎn)生。CUMS可以通過刺激炎因子的釋放而形成炎癥，導(dǎo)致冠狀動脈病變。表明炎癥因子可能作為冠心病的一個預(yù)測因子，心理應(yīng)激也能夠增加冠心病的風(fēng)險。

綜上所述，慢性溫和性應(yīng)激能夠誘導(dǎo)大鼠心肌損傷，關(guān)于心肌損傷的機制仍需進一步研究。但同時表明，心血管疾病患者應(yīng)在關(guān)注原發(fā)疾病時亦應(yīng)關(guān)注患者的心理健康，緊靠“雙心”醫(yī)學(xué)理念，為心血管疾病提供新的治療策略。