蠐螬提取物對脈絡膜新生血管中趨化因子受體3及其配體嗜酸性粒細胞趨化因子表達的影響

文小娟 蔣鵬飛 彭俊 李建超 周亞莎 彭清華

[摘要]目的觀察蠐螬提取物口服、滴眼兩種給藥途徑對實驗眼脈絡膜新生血管（Choroidal neovascularization，CNV）組織的趨化因子受體3（chemokine receptor 3.CCR3）及其配體嗜酸性粒細胞趨化因子（eOSinophil activated chemotactic factor，Eotaxin）表達的影響。方法選用8周齡雄性BN大鼠32只，隨機數字表法平均分成空白組、模型組、口服組、滴眼組，予以不同干預措施。采用YAG激光建立CNV大鼠模型，于造模后7、28d行熒光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography，FFA）檢查，造模后28d行免疫組化CCR3及其配體Eotaxin染色及其結果觀察分析。結果FFA檢查顯示：造模后7d除空白組外，各組均造模成功;造模后28d口服組與滴眼液熒光滲漏減少。CCR3及Eotaxin免疫組化結果示：口服組與滴眼組CCR3及Eotaxin含量較模型組減少，差異有統計學意義（P<0.05）;口服組與滴眼組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。結論蠐螬提取物兩種給藥途徑均可抑制實驗性CNV模型中CCR3及其配體Eotaxin的表達，從而抑制實驗性CNV的形成。

[關鍵詞]年齡相關性黃斑變性;脈絡膜新生血管;蠐螬提取物;趨化因子受體3;嗜酸性粒細胞趨化因子

[中圖分類號]R285.5;R276.7[文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.007

年齡相關性黃斑變性（age related maculat dc-generadon，AMD）是一種發病率與年齡增長正相關的疾病，也是眼科高致盲眼病之一，隨著我國人口進入老年化，AMD發病人群日漸增長。滲出型AMD又稱濕性AMD，是AMD的一種類型，特點為病變易發生脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV），新生血管屬于異常增生血管，脆性大，較正常血管容易破裂出血，對視力影響較為明顯。本研究通過建立CNV動物模型，觀察了蠐螬提取物口服劑與滴眼液對實驗性CNV中趨化因子受體3（chemok-inereceptor 3.CCR3）及其配體嗜酸性粒細胞趨化因子（eosinophil activated chemotactic factor，Eotaxin）的影響，為從中醫藥角度探索防治滲出性AMD提供思路。

1實驗材料與方法

1.1實驗動物

成年BN大鼠32只，雄性，體質量180-200g，實驗前排除全身性及眼部疾患，湖南中醫藥大學實驗動物中心清潔級條件下飼養，許可證號：SYXK（湘）2013-0005。動物由北京微通利華實驗動物有限公司提供，動物合格證號：11400700096597。選用8周齡BN大鼠32只，雄性，實驗前行雙眼前節和眼底檢查未發現異常改變。將32只大鼠采用隨機數字表法平均分成空白組、模型組、口服組、滴眼組，每組8只。

1.2 實驗藥品及試劑

參照已有方法制備蠐螬提取物和蠐螬提取物滴眼液;兔抗鼠CCR3單克隆抗體（批號：Bs-1167R）、兔抗鼠EOTAXINl單克隆抗體（批號：Bs-1601R）均購自北京博奧森生物技術有限公司：羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB23303）;PV9000通用型免疫組化染色試劑盒（批號：K156617J）、DAB濃縮型顯色試劑盒（批號：K157716A）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3實驗儀器設備

萊特眼底激光治療儀（法國Quantel公司）、海德堡眼底熒光造影儀（德國Heidelberg公司）、海德堡光學相干斷層掃描儀（德國Heidelberg公司）、裂隙燈顯微鏡（Topcon公司）、ZDS-10型自動換擋數字式照度計（北京精誠華泰儀表有限公司）、RM2235型輪轉石蠟切片機（德國徠卡公司）、YD-A型生物組織攤片機（上海金迪生物技術工程有限公司）、MoticBA410研究型顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）、Motic 6.0數碼醫學圖像分析系統（麥克奧迪實業集團有限公司）。

1.4模型制備

參考譚涵宇等的制備方法：模型組、口服組、滴眼組大鼠腹腔內注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉藥，按45mg/kg，用復方托比卡胺滴眼液擴瞳。通過裂隙燈前置鏡，采用532nm倍頻Nd：YAG激光（光斑直徑75Irm，曝光時間100ms，能量180mW），距視盤約1-1.5PD，在視乳頭周圍擊射視網膜，每眼擊射8-10個點，避免直接擊射視網膜血管。成功標準：通過激光光凝后小氣泡產生，并可伴少量出血，表示已經擊破BruchS膜。

1.5干預方法

口服組予以蠐螬提取物，按5.6g/kg蒸餾水稀釋至2mL灌胃，相當于成人日用量3倍劑量，1次/日：滴眼組予以蠐螬滴眼液滴眼，4次/d;空白組、模型組、滴眼組蒸餾水2mL灌胃，空白組、模型組、口服組予以玻璃酸鈉滴眼液滴眼，4次/d。造模后第1天分別開始給藥，持續4周。

1.6 取材與固定

分別于激光后28d觀察期結束后過量麻醉處死動物，即刻摘除眼球。每只大鼠均選取左眼球于睫狀體扁平部做一小切口，4%福爾馬林固定24h，流水沖洗，將角膜及晶狀體去除后，在距視乳頭顳側1PD及1.5PD處做垂直于視網膜血管的視網膜、脈絡膜及鞏膜全層取材。將所取標本乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡2次，每次30min。石蠟包埋，做4um厚的切片，烘干備用。石蠟切片常規脫蠟至水，用3%H₂O₂室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，3minx3次。滴加物素標記二抗工作液，37℃孵育10-15min。PBS沖洗，3minx3次。滴加試劑辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10-15min。PBS沖洗，3minx3次。DAB顯色劑顯色。自來水充分沖洗，封片。

1.7 測試指標

1.7.1 行熒光素眼底血管造影（fluoreseein fundus an-giography，FFA）檢查 光凝后7、28d對模型組、口服組、滴眼組行FFA檢查。BN大鼠腹腔內按45mg/kg注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉藥，用0.5%托比卡胺+0.5%鹽酸去氧腎上腺素點眼散瞳。10%熒光素鈉1mL注射后，立即開始攝影，持續約10min。觀察有無灌注區、有無新生血管。

1.7.2 CCR3及Eotaxin免疫組織化學檢測 于400倍目鏡下觀察，每張切片均選取免疫組化陽性染色最多的4個視野框，用Mias-2000圖形分析系統測定視網膜色素上皮層以下至脈絡膜間測量框內染成棕黃色的CCR3及Eotaxin的積分光密度值。

1.8統計學處理

數據采用SPSS 17.0統計軟件處理，各項指標均以“x±s”表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用g檢驗（S-N-K法）;非正態性、方差不齊的計量資料，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05認為有統計學意義。

2結果

2.1 FFA

造模7d時，空白組FFA檢查顯示未見明顯異常，模型組、口服組、滴眼組均可見熒光滲漏，見圖1：造模28d時，空白組無明顯改變，模型組熒光滲漏明顯增多，口服組、滴眼組熒光滲漏減少，見圖2。

2.2 CCR3及Eotaxin免疫組化

經染色后可見視網膜色素上皮層至脈絡膜之間有CCR3陽性表達。空白組CCR3陽性表達較少（圖3A），模型組CCR3陽性表達明顯增多（圖3B），且與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05）：口服組與滴眼組CCR3陽性表達較模型組均減少（圖3C-D），與模型組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;口服組與滴眼組相比，差異無統計學意義（p>0.05）。見表1。

空白組Eotaxin在視網膜及脈絡膜血管內皮細胞陽性表達較少（圖4A），模型組陽性細胞染色面積及密度明顯增加（圖4B），模型組與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05）：口服組與滴眼組較模型組的Eotaxin表達減少（圖4C-D），差異有統計學意義（P<0.05），口服組與滴眼組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3討論

西醫對AMD多采取激光治療、光動力療法等，雖然取得一定療效，但復發率高，玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物療效較好，但需多次注射，價格昂貴。老年黃斑變性在中醫學屬于“視瞻昏渺、視直如曲”的范疇。肝腎不足、精血虧虛有關，若年老體虛，肝腎不足，精血虧虛，黃斑失養則發生AMD。我們通過長期的臨床觀察認為，痰瘀互結是AMD發病的重要環節，提出在補腎明目的基礎上，結合活血祛瘀、化痰散結治療AMD。濕性AMD伴有視網膜的水腫、滲出，干性AMD伴有視網膜痰瘀互結，因此，本病過程中，始終存在著痰、瘀夾雜的病機，而蠐螬有破血、行瘀、散結、解毒、消瘡、明目的功能，契合AMD的病機，有較好的應用前景。

蠐螬早在《神農本草經》中就作為蟲草類藥材被記載，如“蠐螬，生河內平澤及人家積糞草中：取無時：反行者良”。隨后歷代醫書典籍都有相關記載，如宋朝醫者陳抃在《陳氏經驗方》中有“《晉書》吳中書郎盛沖母王氏失明，婢取蠐螬蒸熟與食，王以為美，沖還知之，抱母慟哭，母目即開。”《本草綱目》中有蠐螬治療目中青翳白膜的記載。蠐螬性微溫，有毒性，藥用蠐螬為節肢動物門昆蟲綱鞘翅目的鰓金龜科Mclolon-thidae、金龜子科Scara-bacidae等金龜總科的幼蟲。具有破血逐瘀、明目退翳的功效，含有豐富的氨基酸、多肽或蛋白質、脂肪、外細胞糖酶，蔗糖酶等多種酶：其藥理作用主要有收縮血管、利尿、抗腫瘤、抗菌、保肝等作用。已有大量文獻表明蠐螬含有大量對CNV有抑制作用的物質，張慶鎬等對蠐螬礦物元素和維生素含量測定表明：蠐螬中B族維生素含量較高，維生素A、E的含量也較豐富。而維生素A有增強機體免疫功能的作用，維生素E有抗氧化作用，這兩種維生素均可抑制CNV發生時出現的氧化應激損傷。也有研究表明蠐螬提取物中精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-絲氨酸連接而成的短膚鏈對實驗性CNV有抑制作用。

目前針對新生血管眼病的研究仍以抗VEGF治療為研究熱點，而新生血管的發生、發展涉及多種細胞因子。本課題組前期已有研究證明：蠐螬提取物可以抑制實驗性家兔CNV中VEGF和bFGF的表達，減輕NO的過量生成對視網膜、視神經細胞造成的毒性作用，有效保護視網膜、視神經細胞。已有研究證實CCR3及其特異性的配體參與濕性AMD的病理改變，CCR3及其配體在實驗性CNV中出現高表達，予CCR3拮抗劑干預后該表達明顯被抑制，說明CCR3信號在CNV的發展中有重要的作用。

CCR3是一種趨化因子受體，屬G蛋白偶聯受體家族。該基因具有多態性，位于染色體3p21.3.在嗜酸性粒細胞、肥大細胞、Th2淋巴細胞、嗜堿性粒細胞等均有表達，既往關于CCR3的研究方向主要以嗜酸性粒細胞為主，然而，通過實驗性鼠CNV標本及AMD患者病變部標本發現，CCR3在CNV的表達過程中嗜酸性粒細胞并沒有改變。該結果表明CCR3在新生血管中的表達途徑與在變態反應性疾病不同。已有研究證實CCR3對新生血管的發生主要是與其配體Eotaxin刺激誘導新生血管發生機制有關。CCR3配體包括Eotaxin-1（CCL-11）、Eotaxin-2（CCL-24）和Eotaxin-3（CCL-26）、趨化因子Rants、巨噬細胞炎性蛋白-la（MIP-1a）、單核細胞趨化蛋白MCP-2、MCP-3、MCP-4等，最主要的是CCL類配體。研究表明應用CCR3拮抗劑可抑制實驗性CNV模型中CNV的體積。應用CCR3中和抗體可使實驗性CNV模型中血管滲漏減少。這些研究同時證實了CCR3信號參與CNV的形成。赫雪飛等研究發現CCR3能抑制血管發生，使用CCR3拮抗劑能明顯抑制實驗性角膜新生血管的發生。

本實驗結果顯示，實驗性CNV模型組較空白組CCR3及Eotaxin表達明顯上調，經蠐螬提取物干預后其表達均有不同程度降低。實驗證實了CCR3及Eotaxin的表達在實驗性CNV中可明顯增加。同時表明蠐螬提取物滴眼液與口服劑均能抑制實驗性CNV后CCR3及Eotaxin的表達，從而抑制了新生血管的發生和發展。