鴨胚成纖維細胞上坦布蘇病毒受體蛋白的鑒定

趙冬敏 韓凱凱 劉青濤 黃欣梅 楊婧 劉宇卓

摘要：【目的】拓展對坦布蘇病毒受體的認知，為研究其在鴨體內(nèi)的感染機制打下基礎(chǔ)。【方法】取9日齡SPF鴨胚制備鴨胚成纖維細胞（DEF），待細胞長成單層后提取DEF膜蛋白，利用免疫共沉淀試驗篩選出DEF膜蛋白中可與坦布蘇病毒結(jié)合的蛋白，經(jīng)病毒輔覆蛋白結(jié)合分析（VOPBA）驗證后通過LC-MSMS質(zhì)譜分析進行鑒定;同時人工合成鴨熱休克蛋白70基因（HSP70）序列的開放閱讀框（1905 bp），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-HSP70并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，以重組蛋白免疫小鼠制備抗鴨HSP70血清，與DEF細胞共孵育后接種坦布蘇病毒，并采用實時熒光定量PCR檢測抗血清對病毒感染的抑制作用。【結(jié)果】DEF膜蛋白中分子量約70 kD的蛋白可與坦布蘇病毒結(jié)合，經(jīng)LC-MSMS質(zhì)譜分析和序列比對可確定該蛋白即為鴨熱休克蛋白70（HSP70）。含重組質(zhì)粒pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受態(tài)細胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)在分子量約85 kD處出現(xiàn)目的蛋白條帶，獲得的重組鴨HSP70蛋白主要以包涵體形式進行表達，且能與His標簽抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。以重組鴨HSP70蛋白免疫小鼠獲得的抗鴨HSP70血清可封閉DEF細胞上的HSP70，而競爭性抑制坦布蘇病毒感染。【結(jié)論】HSP70是坦布蘇病毒感染DEF細胞的受體，可作為新的靶點用于抗坦布蘇病毒藥物設(shè)計。

關(guān)鍵詞： 坦布蘇病毒;鴨胚成纖維細胞;熱休克蛋白70;受體;免疫共沉淀;病毒輔覆蛋白結(jié)合分析（VOPBA）

中圖分類號： S852.657? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0173-06

0 引言

【研究意義】自2010年以來，坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）在我國多個省（市）鴨、鵝養(yǎng)殖場引起一種以食欲急劇減退、產(chǎn)蛋量驟降為主要特征的新發(fā)疫病，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失（趙冬敏等，2014;黃欣梅等，2015）。坦布蘇病毒感染率最高可達100%，死亡率5%～30%（Su et al.，2011）。除鴨和鵝外，坦布蘇病毒還可自然感染雞、鴿子和麻雀等禽類（Tang et al.，2013）。在人工攻毒條件下，坦布蘇病毒可感染小鼠并表現(xiàn)出對神經(jīng)系統(tǒng)的致病力（Zhang et al.，2017）。體外培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，坦布蘇病毒在哺乳動物細胞系（Vero、BHK-21、Hela、HepG2和SH-SY5Y）、禽源細胞系（DEF、CEF、GEF和DF-1）和蚊細胞系（C6/36和白紋伊蚊細胞）中均表現(xiàn)出良好的繁殖特性（Zhang et al.，2017），說明其感染宿主譜極其廣泛。因此，明確坦布蘇病毒在不同動物體內(nèi)的感染機制，對科學(xué)防控坦布蘇病毒病具有重要意義。【前人研究進展】坦布蘇病毒隸屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus），該屬病毒還包括登革病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒和寨卡病毒等蟲媒病毒（趙冬敏等，2017）。黃病毒屬病毒囊膜蛋白以延伸的二聚體形式平鋪于病毒表面，在病毒感染細胞的過程中，囊膜蛋白作為吸附蛋白與細胞表面的受體分子結(jié)合，使病毒粒子吸附于靶細胞，隨后通過內(nèi)吞作用進入細胞（Smit et al.，2011）。黃病毒屬病毒感染不同細胞時所使用的受體具有多樣性，不同細胞型表面的不同分子均有可能成為受體。Liu等（2017）通過免疫共沉淀和病毒輔覆蛋白結(jié)合分析（VOPBA）鑒定出熱休克蛋白A9是坦布蘇病毒在DF-1細胞上的受體分子;Zhao等（2018）利用VOPBA分析和間接免疫熒光法證實GRP78作為受體分子參與坦布蘇病毒感染BHK-21細胞。受體的分子類型依賴于細胞類型和病毒血清型，已有研究結(jié)果顯示，CD14相關(guān)蛋白（Chen et al.，1999）、整合素β3（Chu and Ng，2004）、GRP78/BiP （Jindadamrongwech et al.，2004）、高親和性層粘連蛋白（Thepparit and Smith，2004）、熱休克蛋白90/70（Reyes-Del Valle et al.，2005）、DC-SIGN（Pokidysheva et al.，2006）、硫酸乙酰肝素（Pattnaik et al.，2007）、凝集素（Chen et al.，2008）和微管蛋白的β鏈（Fang et al.，2013）等均可作為黃病毒屬病毒感染不同細胞時的受體，而這些受體正是研發(fā)抗黃病毒屬病毒藥物的潛在靶點。【本研究切入點】坦布蘇病毒感染宿主譜十分廣泛，但針對其受體的研究較少，且至今尚無坦布蘇病毒感染鴨胚成纖維細胞（DEF）受體鑒定的相關(guān)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用免疫共沉淀試驗分離DEF細胞膜中能與坦布蘇病毒結(jié)合的受體蛋白，經(jīng)VOPBA驗證后通過LC-MSMS質(zhì)譜分析進行鑒定，旨在拓展對坦布蘇病毒受體的認知，為研究其在鴨體內(nèi)的感染機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

坦布蘇病毒JS804株和坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病與生物獸藥研究室保存提供;9日齡SPF鴨胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所;細胞膜蛋白提取試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;Protein A+G瓊脂糖、His標簽抗體和堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1. 2 DEF細胞制備

取9日齡SPF鴨胚置于蛋托上，以75%酒精棉球擦拭蛋殼，隨后在氣室部位將蛋殼擊碎，用無菌剪刀將卵膜剪開，取出鴨胚，去除鴨胚四肢、眼、喙、內(nèi)臟及腦組織。以PBS洗滌鴨胚后放入小燒杯中剪碎，PBS洗滌剪碎的鴨胚，靜置5 min，棄上清液;加入1.0 mL胰酶37 ℃消化10 min，再加入10.0 mL含5%胎牛血清的DMEM終止反應(yīng)，用吸管吹打數(shù)次后進行細胞計數(shù)。計數(shù)后吸取上清液分裝于細胞瓶中，每瓶約5×106個細胞。

1. 3 DEF膜蛋白提取

以胰酶消化長成單層的DEF細胞，用含5%胎牛血清的DMEM終止反應(yīng)，2000 r/min離心5 min，收集細胞，根據(jù)細胞膜蛋白提取試劑盒說明提取DEF膜蛋白。提取的DEF膜蛋白分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 免疫共沉淀試驗

（1）去除非特異性結(jié)合：取400.0 μL提取的DEF膜蛋白，加入10.0 μL陰性小鼠血清和20.0 μL Protein A+G瓊脂糖，4 ℃搖床（緩慢搖動，下同）孵育2 h;3500 r/min離心5 min，取上清液用于后續(xù)試驗。（2）免疫共沉淀：于上述上清液中加入400.0 μL純化的坦布蘇病毒，4 ℃搖床孵育5 h，再加入10.0 μL坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體，4 ℃搖床孵育過夜;加入20.0 μL充分重懸的 Protein A+G瓊脂糖，4 ℃搖床孵育3 h。3500 r/min離心5 min，小心棄除上清液，沉淀用PBS洗滌5次，加入40.0 μL 4×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液重懸沉淀，沸水處理5 min后進行SDS-PAGE檢測。對照組不加坦布蘇病毒，其余操作相同。電泳結(jié)束后進行考馬斯亮藍染色，并將篩選獲得的蛋白條帶切下送至上海博苑生物科技有限公司進行LC-MSMS質(zhì)譜分析。

1. 5 VOPBA分析

對提取的DEF膜蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至NC膜上，利用3%牛血清白蛋白封閉后，加入純化坦布蘇病毒，4 ℃孵育過夜。NC膜以PBST洗滌3次，加入坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體，37 ℃孵育1 h后用PBST洗滌3次，加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG，37 ℃再孵育1 h。孵育結(jié)束后，以PBST洗滌3次，利用堿性磷酸酶顯色試劑盒進行顯色反應(yīng)。對照組不加入坦布蘇病毒，其余操作相同。

1. 6 鴨熱休克蛋白70（HSP70）原核表達及鑒定

根據(jù)蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果和GenBank已公布的鴨HSP70基因序列（EU678246.2），人工合成鴨HSP70基因序列的開放閱讀框（1905 bp），并分別在5'和3'端加入Sal I（GTCGAC）和Not I（GCGGCCGC）酶切位點。在合成鴨HSP70基因片段的Sal I和Not I位點插入pET32a原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后選取酶切鑒定呈陽性的重組質(zhì)粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-HSP70。將含pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受態(tài)細胞接種至含100 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.4，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)4 h后收集菌液，6000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用PBS重懸，超聲波破碎15 min后6000 r/min離心10 min，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE檢測。同時將表達蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5% BSA在37 ℃下封閉2 h，PBST（含0.05% Tween-20）洗滌3次，加入抗His標簽抗體，4 ℃孵育過夜;PBST洗滌3次，加入堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h;PBST洗滌3次，加入堿性磷酸酶底物顯色。

1. 7 抗鴨HSP70血清制備

將純化的重組鴨HSP70蛋白與等量弗氏完全佐劑完全乳化后免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，免疫劑量為70 μg/只。每隔2周加強免疫1次，共免疫3次，最后一次免疫后2周采集血清。以提取的DEF膜蛋白包被ELISA板，利用間接ELISA檢測血清中抗重組鴨HSP70蛋白的抗體效價（朱文姣等，2018）。

1. 8 抗鴨HSP70血清對坦布蘇病毒感染的抑制作用

接種DEF細胞于48孔板中，長成單層后與終濃度為100 μg/mL的抗鴨HSP70血清4 ℃共孵育1 h。對照組DEF細胞與空白小鼠的陰性血清進行共孵育，其余操作相同。棄孵育上清液，以冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，接種坦布蘇病毒，4 ℃孵育30 min后再37 ℃孵育1 h。棄上清液，以冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，37 ℃孵育24 h。收集細胞，利用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）試劑盒提取RNA，按照HiScript II Q select RT SuperMix for qPCR（諾唯贊）說明進行反轉(zhuǎn)錄。以合成的cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測坦布蘇病毒核酸，并以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?△△Ct計算其相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DEF膜蛋白與坦布蘇病毒的免疫共沉淀試驗結(jié)果

利用免疫共沉淀試驗篩選DEF膜蛋白中可與坦布蘇病毒結(jié)合的蛋白，SDS-PAGE檢測結(jié)果（圖1）顯示，約在70 kD處出現(xiàn)1條目的蛋白條帶，而對照組未出現(xiàn)對應(yīng)的目的條帶。將分子量約70 kD的蛋白條帶切下送至上海博苑生物科技有限公司進行LC-MSMS質(zhì)譜分析。

2. 2 DEF膜蛋白與坦布蘇病毒結(jié)合的驗證結(jié)果

為進一步驗證DEF膜蛋白與坦布蘇病毒的結(jié)合作用，對提取的DEF膜蛋白進行SDS-PAGE檢測并轉(zhuǎn)印至NC膜上，與純化坦布蘇病毒孵育后進行VOPBA分析。結(jié)果顯示，在分子量約70 kD處通過坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體檢測到1條蛋白條帶（圖2），與免疫共沉淀試驗結(jié)果一致;而對照組未出現(xiàn)對應(yīng)的目的條帶，故確定DEF膜蛋白中分子量約70 kD的蛋白可與坦布蘇病毒結(jié)合。

2. 3 LC-MSMS質(zhì)譜分析結(jié)果

為確定分子量約70 kD的蛋白是何種蛋白，將該蛋白條帶切下送至上海博苑生物科技有限公司進行LC-MSMS質(zhì)譜分析，并將質(zhì)譜分析結(jié)果（表1）輸入鴨蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)得分最高的蛋白為鴨熱休克蛋白70（HSP70）。鑒于檢測到的其他幾種蛋白為細胞生長、代謝和凋亡等相關(guān)蛋白，同時參考其他黃病毒屬病毒的HSP70受體（Das et al.，2009），因此，可確定通過免疫共沉淀和VOPBA分析篩選獲得可與坦布蘇病毒結(jié)合的蛋白即為鴨HSP70。

2. 4 鴨HSP70蛋白原核表達及鑒定結(jié)果

SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，含重組質(zhì)粒pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受態(tài)細胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后，可在分子量約85 kD處出現(xiàn)目的蛋白條帶（圖3）。經(jīng)超聲波破碎后的SDS-PAGE檢測結(jié)果（圖4）顯示，重組鴨HSP70蛋白主要以包涵體形式進行表達。利用His標簽抗體進行Western blotting鑒定，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的菌液在分子量約85 kD處出現(xiàn)能與His標簽抗體反應(yīng)的特異性條帶（圖5）。

2. 5 抗鴨HSP70蛋白血清效價測定結(jié)果

用提取的DEF膜蛋白包被ELISA板，以重組鴨HSP70蛋白免疫小鼠血清為一抗，采用間接ELISA測定其血清效價，結(jié)果表明，免疫小鼠產(chǎn)生了抗鴨HSP70蛋白的抗體，抗體效價達1∶400。

2. 6 抗鴨HSP70血清對坦布蘇病毒感染的競爭性抑制作用

為檢驗抗鴨HSP70血清是否可封閉DEF細胞上的HSP70而抑制坦布蘇病毒感染，在接種坦布蘇病毒前加入抗鴨HSP70血清與DEF細胞進行共孵育，對照組采用空白小鼠的陰性血清進行共孵育。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖6）顯示，與對照組相比，抗鴨HSP70血清孵育DEF細胞中的坦布蘇病毒含量顯著降低（P<0.05），說明抗鴨HSP70血清可結(jié)合HSP70而封閉受體，競爭性抑制坦布蘇病毒感染。

3 討論

熱休克蛋白（HSP）是從細菌到哺乳動物廣泛存在的一類高度保守的熱應(yīng)激蛋白，按其分子量大小可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP和泛素，其中最主要的是HSP70家族（張杰等，2017）。HSP70在進化上高度保守，可劃分為3個功能域：N端為45 kD的ATPase活性結(jié)構(gòu)域，緊接著為18 kD的多肽結(jié)合域及C端功能尚不明確的10 kD結(jié)構(gòu)域（任寶波等，2005）。HSP70已被鑒定為登革病毒感染單核細胞、巨噬細胞及C6/36細胞時的受體（Fang et al.，2013;張響英等，2017）。此外，Reyes-Del Valle等（2005）研究表明，HSP70和HSP90是登革病毒侵入人類神經(jīng)母細胞瘤所需受體復(fù)合物的組成部分;Das等（2009）研究證實HSP70是乙型腦炎病毒感染蚊細胞和神經(jīng)細胞（Neuro2A細胞）時的受體。可見，HSP70作為受體或受體復(fù)合物的一部分在黃病毒屬病毒入侵宿主細胞的過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫共沉淀試驗分離出坦布蘇病毒感染DEF細胞的受體是分子量為70 kD的蛋白，通過LC-MSMS質(zhì)譜分析確定該蛋白為HSP70，首次鑒定出坦布蘇病毒在DEF細胞中的受體，為進一步研究鴨坦布蘇病毒的感染和致病機制打下基礎(chǔ)。

病毒吸附蛋白與細胞受體分子間的相互作用介導(dǎo)病毒進入宿主細胞，目前認為這種相互作用與病毒的宿主譜、組織嗜性和致病機制有關(guān)。病毒—受體的相互作用是一個多步驟過程，且該過程中可能依次涉及多種受體或輔助受體（Reyes-Del Valle et al.，2005）。黃病毒屬病毒感染細胞所需的受體呈多樣性，且依賴于細胞類型和病毒血清型，即使同一細胞也可能采用不同分子作為受體（Liu et al.，2017）。本研究結(jié)果雖然顯示抗鴨HSP70血清對坦布蘇病毒感染具有競爭性抑制作用，但并不能完全抑制病毒感染，說明在DEF細胞中還存在其他受體分子，具體是何種受體尚有待進一步探究。

4 結(jié)論

HSP70是坦布蘇病毒感染DEF細胞的受體，可作為新的靶點用于抗坦布蘇病毒藥物設(shè)計。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）