大孔吸附樹脂純化山楂葉黃酮工藝研究

周志強　馬嬌豪

摘要：對4種大孔吸附樹脂純化山楂葉黃酮效果比較分析，結(jié)果顯示，D101型大孔吸附樹脂對山楂葉黃酮溶液吸附和解吸附效果較好。對山楂葉黃酮純化工藝進行研究，確定了最優(yōu)的純化工藝條件為：采用上柱流速為2BV/h，樣液pH值為4.0為上柱吸附條件，洗脫液為70%的乙醇溶液，洗脫液用量為4BV，解析液流速為2BV/h解吸附最優(yōu)條件。采用D101型大孔吸附樹脂純化后，產(chǎn)品純度可達94.62%，可用于保健品的分離純化。

關(guān)鍵詞：大孔吸附樹脂;山楂葉黃酮;純化工藝

山楂葉含有豐富的氨基酸、微量元素及豐富的維生素，山楂葉中的黃酮類物質(zhì)具有一定的清除自由基功能，對心血管系統(tǒng)有一定的藥理作用。大孔吸附樹脂是近幾年發(fā)展起來的一類有較好吸附性能的有機高聚物吸附劑，具有價廉、反復(fù)利用、吸附容量大等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于各類黃酮物質(zhì)的分離純化，如，山楂黃酮、葛根黃酮、陳皮黃酮、枸杞黃酮、櫻桃葉黃酮的分離純化。

本實驗對D101、HPD-200、HPD-500、HPD-600型大孔吸附樹脂進行篩選，并對大孔吸附樹脂分離純化山楂葉總黃酮的吸附率和解吸率進行研究，為山楂葉黃酮化合物提取提供適宜的分離純化條件。

一、材料與方法

（一）材料與試劑

山楂葉：太行山上山楂樹落葉前的綠葉;HP-20型大孔吸附樹脂購置于日本三菱公司，非極性D-101型大孔吸附樹脂購置于天津市海光化工有限公司，HPD-200型大孔吸附樹脂、HPD-500型大孔吸附樹脂、HPD-600型大孔吸附樹脂均由河北滄州寶恩化工有限公司提供。

主要試劑有：蒸餾水（pH7.0～8.0）、NaOH（分析純）、NaNO（分析純）、硝酸鋁Al（NO），（分析純）、95%乙醇（分析純）。

（二）儀器和設(shè)備

主要食品設(shè)備：

冷凍干燥機（上海翡諾醫(yī)藥設(shè)備有限公司）、真空干燥箱（上海皓莊儀器有限公司）、玻璃樹脂柱（3cm×50cm）和7200型分光光度計（上海尼龍柯儀器有限公司）、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（北京鑫骉騰達儀器設(shè)備有限公司）、BT25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

（三）大孔吸附樹脂的預(yù)處理

用蒸餾水洗去破碎樹脂粒，濕法裝柱，將大孔吸附樹脂用適量95%乙醇浸泡24h，然后除去上清液，繼續(xù)用3BV95%乙醇沖洗至洗出液不渾濁，再用蒸餾水洗至洗出液無醇味;再用3BV的5%稀鹽酸以2mL/dmin流速沖洗樹脂，浸泡1h后再用蒸餾水以2mL/min流速沖洗至中性;最后用3BV20g/L的氫氧化鈉溶液以相同的流速沖洗樹脂，浸泡1h后用蒸餾水沖洗樹脂層至流出液pH值為中性。

（四）蘆丁標準曲線繪制

稱取20.8mg蘆丁，用60%的乙醇溶解并稀釋至100mL，作為對照品溶液。精密量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分別置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%NaNO溶液1mL，使混勻放置6min，然后用1mL移液管移取10%的Al（NO）溶液1mL，使混勻放置6min，然后用10mL移液管移取4%的NaOH溶液10mL，再加水至刻度，搖勻放置15min，并做空白對照。按分光光度法在500nm波長處測定吸收度，所取標準溶液的濃度和吸收度數(shù)據(jù)經(jīng)回歸分析，得回歸方程為：y=11.687265x-0.008186，R=0.999719，結(jié)果表明，蘆丁濃度在0.0083～0.04992mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

（五）樣品溶液制備

樣品溶液取自曹樂民（參考文獻7）等人通過傳統(tǒng)工藝提取的山楂葉黃酮浸提液。

（六）山楂葉黃酮提取液分離純化工藝

山楂葉提取液→濾液上柱吸附→解吸→濃縮→干燥→山楂葉黃酮產(chǎn)品。

（七）山楂葉黃酮類物質(zhì)含量測定

用1mL移液管取靜置冷卻后的濾液1mL至250mL容量瓶中，再用5mL移液管移取5mL蒸餾水進行稀釋，按照標準曲線制作的方法，在500nm波長下，測定溶液吸光度，再由標準曲線方程計算溶液黃酮濃度。

（八）大孔吸附樹脂吸附率和解吸率的測定

1、大孔吸附樹脂吸附容量和吸附率測定。準確稱取處理好的濕樹脂2.0g，吸干后裝入100mL帶塞磨口錐形瓶中，加入山楂葉黃酮水溶液樣液50.00mL（V0），濃度為1.438mg/mL（C），置于搖床上（溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r/min）振蕩吸附24h后過濾，測定濾液中黃酮類物質(zhì)的濃度，計算大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率，計算公式如下：

3、大孔吸附樹脂的吸附動力學(xué)特征。稱取預(yù)處理過的大孔吸附樹脂2.0g（濕重）于帶塞錐形瓶中，精密量取50.00mL黃酮溶液，置于搖床上（溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r/min）振蕩吸附，在12h內(nèi)，每次取1.00mL。以大孔吸附樹脂與樣液接觸時開始計時，然后按下列時間10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h，以大孔吸附樹脂的黃酮靜態(tài)吸附量（E）對時間（t）作圖，繪制大孔吸附樹脂的吸附動力學(xué)曲線。

二、結(jié)果與討論

（一）大孔吸附樹脂的篩選

1、不同大孔吸附樹脂對山楂葉黃酮溶液的吸附效果。稱取4種經(jīng)過預(yù)處理的大孔吸附樹脂各2.0g于100mL磨口帶塞錐形瓶中，分別加入50.00mL山楂葉黃酮水溶液，于搖床上（溫度25℃，轉(zhuǎn)速150r/min）振蕩吸附24h后抽濾，測定濾液中黃酮溶液的吸光度，計算靜態(tài)吸附容量和吸附率，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，D101型和HPD-200型大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率明顯較高。因此，可以初步確定選用D101型和HPD-200型大孔吸附樹脂作為實驗用樹脂。

2、不同大孔吸附樹脂對山楂葉總黃酮的解吸附效果。用蒸餾水洗滌樹脂至無色不渾濁，加入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液解吸附，置于搖床上以同樣的方法處理后取出，真空抽濾，測定溶液的吸光度，計算解吸附率，結(jié)果見表2。從表2的解吸附實驗發(fā)現(xiàn)，D101型大孔吸附樹脂較HPD-200型大孔吸附樹脂的解吸附率高，因此，選用D101型大孔吸附樹脂進行吸附和解吸附最合適。

3、大孔吸附樹脂動力學(xué)吸附曲線。4種大孔吸附樹脂的動力學(xué)吸附曲線如圖1所示。

從圖1中可以看出，4種大孔吸附樹脂對樣液的吸附均屬于快速平衡型，3h即達到平衡。不同類型大孔吸附樹脂對樣液中山楂葉總黃酮的吸附速率差異明顯，在4種大孔吸附樹脂中，D101型大孔吸附樹脂吸附容量最大，吸附速率最快。

（二）吸附條件對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

1、上柱流速對樹脂吸附效果的影響。取濃度為1.0mg/mL、pH為4.0的山楂葉黃酮水溶液，分別于1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速上柱吸附，結(jié)果見表3。

從表3中可以看出，上柱流速越小，大孔吸附樹脂的吸附量和吸附率越大。但上柱速率越小，耗費時間就越長，生產(chǎn)成本越高。綜合考慮，上柱流速為2BV/h較合適。

2、樣液濃度對樹脂吸附效果的影響。流速為2BV/h、pH為4.0時，分別以不同濃度的樣液濃度上柱吸附，考察樣液濃度對吸附效果的影響，結(jié)果見表4。

從表4中可以看出，隨著樣液濃度的增加，樹脂的吸附容量和吸附率不是呈線性增加，當(dāng)樣液濃度超過2.0mg/mL時，吸附量和吸附率均下降，說明此時已經(jīng)超過D101大孔吸附樹脂的最大動態(tài)吸附容量，吸附柱開始出現(xiàn)泄漏，因此，樣液濃度為2.0m/mL最合適。

3、樣液pH值對樹脂吸附效果的影響。樣液濃度為2.0mg/mL、上柱流速為2BV/h時，分別以不同pH值的樣液上柱吸附，考察吸附效果，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，在酸性條件下，D101大孔吸附樹脂對樣液中黃酮類物質(zhì)的吸附容量和吸附率沒有明顯差別，但隨著pH值的增大，樹脂的吸附容量和吸附率先增加，增加到一定時間后又降低，以pH值為4.0時，樹脂的吸附量和吸附率最高，因此，吸附液pH以4.0為最佳。

（三）解吸附條件對解吸效果的影響

1、解吸液體積分數(shù)對解吸效果的影響。對靜態(tài)吸附飽和的D101大孔吸附樹脂，采用不同濃度的乙醇溶液對大孔吸附樹脂解吸附，考察不同體積分數(shù)的乙醇溶液對解吸附效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著解吸液乙醇體積分數(shù)的增加，山楂葉黃酮的解吸率不斷增加，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為70%時，大孔吸附樹脂的解吸率趨于穩(wěn)定，考慮到環(huán)境污染、價格成本等因素，選用70%的乙醇溶液作為D101大孔吸附樹脂的解吸液最為合理。

2、解吸液用量對解吸效果的影響。稱取預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂，加入適量的樣液，振搖使樹脂吸附至飽和，用蒸餾水洗至無色;濕法裝柱，然后用70%的乙醇溶液洗脫，流速控制在3BV/h，收集洗脫液，每0.5BV（10min）收集一個餾分，測定洗脫液中總黃酮的濃度，計算解吸附率，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，當(dāng)洗脫液用量為1.8BV時，山楂葉黃酮開始被洗脫下來;洗脫液用量為4BV時，解吸附率約98.7%，樹脂上吸附的絕大部分的黃酮類物質(zhì)被洗脫下來。因此，綜合考慮效率、成本等因素，洗脫液的用量為4BV最佳，即洗脫液用量為柱床體積的3倍時解吸效果是好。

3、解吸附流速對解吸附效果的影響。稱取預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂，加入樣液吸附至飽和，用無色蒸餾水洗至無色，濕法裝柱，用4BV的70%乙醇溶液，分別以1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h的流速對吸附飽和的樹脂洗脫，收集洗脫液，測定解吸附率，結(jié)果見表6。

從表6中可以看出，解吸附流速為1BV/h與2BV/h時，二者解吸附率相近，隨著流速的增加，解吸附率減小，表明流速為2BV/h時，解吸速率高、效果更好。綜合考慮，選擇2BV/h流速作為D101大孔吸附樹脂樹脂的解吸附流速。

（四）大孔吸附樹脂再生性能的確定

以山楂葉黃酮溶液為樣液、上柱流速為2BV/h、樣液pH值為4.0、洗脫液為70%的乙醇溶液、洗脫液用量為4BV、解析液流速為2BV/h為條件，重復(fù)進行實驗，測定D101大孔吸附樹脂的吸附率和解吸附率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D101大孔吸附樹脂重復(fù)進行6次實驗，吸附率和解析率均在94%以上，說明D101大孔吸附樹脂用于山楂葉黃酮溶液的分離純化有較好的重復(fù)使用性能。

（五）山楂葉黃酮純化效果的測定

經(jīng)過D101大孔吸附樹脂處理后，對山楂葉黃酮處理液進行濃縮干燥，樣液中總黃酮得到有效富集純化，總黃酮純度最高可達94.62%。

三、結(jié)論

經(jīng)過對D101、HPD-200、HPD-500、HPD-600四種大孔吸附樹脂對山楂葉黃酮純化效果比較，結(jié)果表明D101大孔吸附樹脂最適合于山楂葉黃酮的純化。

對山楂葉黃酮純化條件篩選試驗結(jié)果表明，采用上柱流速為2BV/h、樣液pH值為4.0為上柱吸附條件;洗脫液為70%的乙醇溶液，洗脫液用量為4BV，解析液流速為2BV/h為解吸附條件時吸附效率和解吸附效率均較高。

經(jīng)過6次重復(fù)對山楂葉黃酮溶液純化后的D101大孔吸附樹脂所得的黃酮純化物純度仍能保持在94.62%，能用于各種保健品的開發(fā)利用，表明D101型大孔吸附樹脂具備較好的重復(fù)使用性能。

（責(zé)任編輯 曹雯梅）