加味丹參飲作用內源性H2S合成途徑保護心肌缺血/再灌注損傷的實驗研究

陳聰 成細華 任婷 吳若霞 周暢 袁夢 廖菁 蔡雄

〔摘要〕 目的 通過觀察益氣活血中藥組方加味丹參飲（JWDS）對心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）模型大鼠血清硫化氫（H2S）合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyse， CSE）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes， CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， DH）含量、心肌組織超微結構、心肌組織CSE mRNA表達的影響，從內源性H2S合成途徑探討JWDS治療MIRI的作用機制。方法 給藥組大鼠按劑量6.19 g/（kg·d）要求給藥14 d，末次給藥2 h后采用結扎冠脈左前降支/再灌流方法復制MIRI模型。HE染色觀察心肌組織機構改變情況;ELISA法檢測血清CK、LDH、CSE含量;Western-blot檢測心肌組織CSE蛋白表達;Real-time PCR檢測心肌組織CSE mRNA表達。結果 JWDS可明顯改善MIRI模型大鼠心肌組織病理改變，降低血清LDH、CK含量（P<0.01），升高CSE含量（P<0.01），上調心肌組織CSE及mRNA表達（P<0.05，P<0.01）。PPG可明顯降低JWDS組大鼠血清CSE含量（P<0.01），下調心肌CSE mRNA表達（P<0.01）。結論 JWDS對實驗性心肌缺血/再灌注（MIR）大鼠心肌損傷具有明顯保護作用，其機制與促進內源性H2S生成從而保護心肌細胞結構，抑制CK、LDH漏出，上調心肌組織CSE蛋白及mRNA表達有關。

〔關鍵詞〕 心肌缺血再灌注;加味丹參飲;益氣活血; H2S;CSE

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.003

Experimental Study on Effects of Jiawei Danshen Decoction on Endogenous H2S Synthesis

Pathway to Protect Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury

CHEN Cong1，2， CHENG Xihua1， REN Ting1， WU Ruoxia1， ZHOU Chang1， YUAN Meng1， LIAO Jing1*， CAI Xiong2*

（1. School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. State Key Laboratory Breeding Base of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Medicine Co-founded by Hunan Province

and Ministry of Science and Technology， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe effects of a prescription for strengthening Qi and promoting blood-Jiawei Danshen Decoction （JWDS） on serum contents of H2S synthetase/cystathionine-γ-lyase （CSE）， creatine kinase isoenzyme （CK） and lactate dehydrogenase （LDH）， myocardial tissue ultrastructure， and CSE mRNA expression in myocardial tissue of model rats with myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI）， so as to explore the mechanism of JWDS in treating MIRI through synthesis pathway of endogenous H2S. Methods Rats in medication group were given medicine 6.19 g/（kg·d） for 14 d， and 2 h after the last medication， the MIRI model was replicated by ligation of left anterior descending coronary artery/reperfusion method. Ultrastructural changes of myocardial tissue were observed by HE staining. The contents of serum CK， LDH and CSE were detected by ELISA method. The expression of CSE protein in myocardial tissue was detected by Western-blot. The expression of CSE mRNA in myocardial tissue was detected by Real-time PCR. Results JWDS significantly improved pathological changes of myocardial tissue in model rats with MIRI， decreased serum LDH and CK contents （P<0.01）， increased CSE content （P<0.01）， and up-regulated CSE and mRNA expression in myocardial tissue （P<0.05， P<0.01）. PPG significantly decreased serum CSE content in rats of the JWDS group （P<0.01）， and down-regulated CSE mRNA expression in myocardial tissue （P<0.01）. Conclusion JWDS demonstrates significant protective effect on myocardial injury in experimental MIRI model rats， which is associated with promoting endogenous H2S generation to protect myocardial cell structure， inhibit CK and LDH leakage， and up-regulate CSE protein and mRNA expression in myocardial tissue.

〔Keywords〕 myocardial ischemia reperfusion; Jiawei Danshen Decoction; strengthening Qi and promoting blood; H2S; CSE

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）是指心肌缺血后冠狀動脈再通，恢復供血后導致的復雜心肌損傷反應，是導致溶栓治療、心臟移植及冠脈搭橋等治療手段失敗的主要原因[1-4]。MIRI可導致包括再灌注性心律失常、心肌頓抑、血液無復流、微血管內皮細胞損傷以及微循環障礙等在內的一系列功能、結構、代謝方面的損傷，臨床治療心血管疾病應盡量避免MIRI帶來的負面作用，對MIRI的臨床表現、發病機制以及防治途徑的研究具有重要意義[5-6]。硫化氫（H2S）是一種類似于一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）的內源性氣體信號分子，主要由胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyse， CSE）催化底物L-半胱氨酸生成[7]。研究發現H2S可自由穿過細胞膜，是細胞防御的內源性機制，外源性H2S干預對離體心臟缺血預處理具有明顯的保護作用[8]。

加味丹參飲（JWDS）是跟據大量臨床經驗，從《時方歌括》丹參飲化裁而來，由黃芪、丹參、檀香、川芎、赤芍等組成，全方共奏益氣活血之功，在臨床上對防治冠心病心絞痛有很好的療效。部分研究證實該方可通過調控細胞凋亡、抗炎等有效途徑的減輕心肌缺血再灌注損傷。但其多環節、多靶點作用的確切機制還未完全闡明。為探究是否通過內源性H2S調節通路對MIRI發揮治療作用，本實驗通過觀察加味丹參飲JWDS對MIRI模型大鼠心肌組織細胞形態、血清合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyse， CSE）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes， CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， DH）含量、心肌組織CSE及mRNA表達的影響，以及H2S合成酶抑制劑PPG對JWDS治療效果的影響，進一步闡釋JWDS保護MIRI的作用機制。

1 材料

1.1? 動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量（200±20）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證編號：SCXK（湘）2014-0008。

1.2? 主要藥物與試劑

加味丹參飲（由丹參、檀香、赤芍、川芎、當歸、紅花、生地黃、黃芪等組成），湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供;LDH、CK、CSE ELISA試劑盒均購于武漢基因美生物，批號201804;硫氫化鈉（NaHS），美國Sigma公司;RIPA（強）組織細胞快速裂解液（批號PAB180006）、Goat-anti-rabbit IgG二抗（批號PAB150011）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號PAB180007）均購于BIOSWAMP公司;Anti-rabbit CSE抗體（批號Ab80643）、Anti-rabbit抗β-Actin抗體（批號Ab8227）均購于美國Abcam公司;Trizol試劑（批號15596026），ambion公司;YBR Green PCR試劑盒（批號KM4101），KAPA Biosystems公司;逆轉錄試劑盒（批號639505），TAKARA公司。

1.3? 儀器

小動物呼吸機（DW-3000，淮北正華生物儀器設備有限公司）;FX-211小動物心電圖機（北京福田電子醫療儀器有限公司）;MK3型酶標儀（芬蘭雷勃）;AC8型自動洗板機（Thermo公司）;TG16W型微量高速離心機（湖南湘儀）;GNP-9080型隔水式恒溫培養箱（上海精宏）;mini protean 3 cell型電泳儀、Real-time PCR、Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統（美國BIO-RAD）;K30型干式恒溫器（杭州爽盛儀器）;Centriguge 5424 R型離心機（德國Eppendorf）;Tanon-5200型ECL分析儀（上海天能）。

2 實驗方法

2.1? 分組與給藥

取SD大鼠70只，按體質量隨機分為空白組、假手術組、MIRI模型組（MIRI組）、缺血預適應組（IP組）、NaHS+MIRI組（NaHS組）、加味丹參飲+MIRI組（JWDS組）、加味丹參飲+PPG+MIRI組（JWDS+PPG組），每組10只。JWDS組與JWDS+PPG組每日以加味丹參飲（6.19 g/kg）灌胃，JWDS+PPG組于再灌注前30 min以CSE合成酶抑制劑PPG（33.9 mg/kg）腹腔注射干預，NaHS組以28 μmol/kg NaHS腹腔注射，空白組、假手術組、MIRI、IP組以等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。每日給藥1次，連續14 d。

2.2? 缺血再灌注模型建立

末次給藥2 h后建立MIRI模型。除空白組外，各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于解剖臺上，頸部備皮消毒。切開氣管，以8號灌胃針進行氣管插管，動物呼吸機（呼吸頻率60～80次/min，潮氣量5～7 mL）輔助呼吸。沿第3/4肋骨上緣打開胸腔暴露心臟，剪開心包，沿冠狀動脈于左前降支下方約2 mm處用無創縫合線結扎冠狀動脈，連續監視心電圖的變化，出現ST段弓背抬高，T波高聳/倒置或左心室變為蒼白色即確認阻斷成功。30 min后放松結扎線，再灌注90 min以ST 段回落1/2以上，T波下降或左心室由蒼白變為暗紅色表示再灌注成功。假手術組僅做開胸處理，不結扎。

2.3? HE染色觀察心肌組織病理變化

取大鼠心肌組織，10%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋，間斷連續切片，HE染色，正置顯微鏡下觀察心肌組織病理變化并拍照。

2.4? ELISA檢測大鼠血清CSE、CK、LDH含量

大鼠心肌缺血/再灌注24 h后，脫頸處死大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，分裝后置于-20 ℃冰箱凍存備用。參照ELISA試劑盒說明，檢測血清CSE、CK、LDH含量。

2.5? Western blot檢測心肌組織CSE表達

取大鼠左心室心肌組織，加入預冷RIPA裂解液研磨，提取總蛋白，測定蛋白含量。制備好的蛋白樣品，經12%SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉至PVDF膜，轉膜后置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，Anti-rabbit CSE/β-actin一抗（CSE 1∶1 000稀釋;β-Actin1∶10 000稀釋）4 ℃下孵育過夜。加HRP標記的Goat-anti-rabbit IgG二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h后，加入ECL發光液顯影，ECL分析系統檢測并拍照，Image J軟件計算條帶吸光度值。

2.6? Real-time PCR檢測心肌組織CSE mRNA表達

再灌注結束后取大鼠左心室組織，Trizol試劑冰上提取總RNA后，測定樣品RNA純度及濃度。以總RNA為模板，按反轉錄試劑盒合成cDNA，進行擴增。引物序列：CSE-F：CCACCACAACGATTACCC;CSE-R：AGTCCAAACTCGGATGCC，引物長度：112 bp;β-Actin-F：CGTTGACATCCGTAAAGAC;β-Actin-R：TAGGAGCCAGGGCAGTA，引物長度：110 bp。PCR擴增條件為：95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 5 s，56 ℃10 s，72 ℃ 25 s循環 40 次。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算CSE mRNA相對表達量。

2.7? 統計學處理

所有數據以Excel表格進行統計，Graphpad prism 7軟件進行分析。結果以“x±s”表示，組間比較以one-way ANOVA單因素方差分析及q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? JWDS對MIRI模型大鼠心肌組織超微結構的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織局部壞死，細胞結構模糊，邊界不清，胞內水腫明顯，心肌細胞走形紊亂。與模型組比較，JWDS組大鼠心肌組織超微結構明顯改善，細胞走形規律，輪廓完整，水腫程度減輕，JWDS+PPG組大鼠心肌組織壞死程度加重，細胞結構破壞，炎性細胞浸潤增多。見圖1。

3.2? JWDS對MIRI模型大鼠血清CSE、CK、LDH含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清LDH、CK含量明顯升高（P<0.01），CSE含量明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，JWDS組LDH、CK含量明顯降低（P<0.01），CSE含量明顯升高（P<0.01）。與JWDS組比較，JWDS+PPG組CSE含量明顯降低（P<0.01）。見圖2。

3.3? JWDS對MIRI模型大鼠心肌組織CSE蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織CSE表達明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，JWDS組CSE表達明顯升高（P<0.05）;JWDS+PPG組CSE蛋白未見明顯改變。見圖3。

3.4? JWDS對MIRI模型大鼠心肌組織CSEmRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織CSE mRNA表達明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，JWDS組CSE mRNA表達升高（P<0.01）。與JWDS組比較，JWDS+PPG組CSE mRNA表達明顯降低（P<0.01）。見圖4。

4 討論

MIRI發病機制主要為心臟經缺血/再灌流刺激，心肌細胞損傷，能量供應障礙，氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產生過多且生成過量脂質過氧化物，細胞內鈣超載觸發線粒體攝取Ca2+增加以及中性粒細胞浸潤引發心肌細胞凋亡或自噬，細胞內LDH、CK等酶類異常升高，最終導致心肌梗死發生。同時再灌注損傷使得心肌代謝產物聚集，大量ROS產生，誘導細胞膜發生脂質化，降低細胞膜流動性，血管內皮細胞受損導致內源性NO合成減少，導致抑制ROS活性及OH生成能力下降[9]。研究發現機體對MIRI具有內源性的保護機制，因此以藥物激活/模擬機體內源性保護機制可以發揮心肌保護作用，且無明顯創傷性，臨床使用更為方便，目前有諸如極化液、阿托伐他汀、環孢霉素A等藥物已被證明具有干預MIRI發生/發展的作用，但鑒于MIRI是一種機制復雜的多因素疾病，對藥物干預MIRI的作用機制及給藥方案研究仍未得出明確結果[10-11]。

H2S是一種無色，有臭雞蛋氣味且易燃的水溶性氣體，以NaHS形式存在于機體內，可分解為Na+與-HS，-HS與體內H+結合形成H2S，隨著血液循環到達靶器官發揮保護作用。H2S是繼NO、CO后發現的第三種內源性氣體信號分子，參與機體內源性保護過程。內源性H2S的合成受CSE調控，CSE活性降低可導致H2S含量減少，減弱其對內皮細胞的保護作用。炔丙基甘氨酸（propargylglycine， PPG）對CSE活性具有不可逆性阻斷作用，抑制機體H2S產生，進而引發或加重心肌缺血/再灌注損傷[12-15]。本實驗研究將JWDS灌胃后14 d的大鼠再灌注前30 min以CSE合成酶抑制劑PPG（33.9 mg/kg）腹腔注射干預。實驗結果顯示，與僅用JWDS組相比，JWDS+PPG組血清中CSE含量明顯降低，大鼠心肌組織損傷明顯加重，心肌CSE表達也明顯降低，可見反饋性加重對H2S合酶CSE的抑制，會使內皮源性H2S進一步減少，心肌損傷加重。實驗結果提示JWDS對心肌的保護作用與H2S生成有較密切的聯系。

中醫認為心肌缺血/再灌注損傷屬“胸痹”范疇，“心脈閉阻”為其基本病機，臨床多以活血化瘀法治療，化瘀之法多以益氣、行氣為主。《靈樞·刺節真邪篇》云：“宗氣不下，脈中之血，凝而留止”;《難經·二十二難》曰：“氣主呴之，血主濡之”;王清任《醫林改錯》云：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣必停留為瘀”;氣能生血、行血和攝血，故“氣為血之帥”，氣虛則血瘀。吳煥林等[16]從319例冠心病患者證候分布規律分析發現，氣虛占87.1%，血瘀占79.9%，提示氣虛血瘀為臨床主要證型。

JWDS是經長期臨床實踐總結出的治療胸痹、防治缺血性心肌病的有效方劑，方中黃芪、丹參補氣活血，當歸、赤芍、川芎、紅花、生地黃活血化瘀、養血和脈，全方共奏益氣活血之效。本課題組前期研究發現JWDS不同配伍組方均對MIRI模型大鼠心肌組織具有保護作用，可抑制p38 MAPK信號通路，降低下游基因COX-2及ICAM-1表達，降低CK、LDH含量，減輕心肌損傷，且丹參、黃芪、赤芍、紅花在組方中發揮主要作用[17-19]。然而JWDS是否通過調節內源性H2S合成發揮心肌保護作用的機制尚不明確，為闡明JWDS與內源性H2S合成的關系，本研究以外源性NaHS與JWDS以及CSE抑制劑（PPG）分別干預實驗大鼠，再以結扎冠脈左前降支/再灌注方法復制MIRI模型，觀察JWDS對MIRI模型大鼠心肌組織超微結構、血清CSE、CK、LDH含量、心肌組織CSE與mRNA表達的影響。結果發現JWDS可明顯改善MIRI模型大鼠心肌組織超微結構，降低血清LDH、CK含量，升高CSE含量，減輕細胞水腫及壞死程度，上調心肌組織CSE與mRNA表達。研究結果顯示JWDS對心肌缺血/再灌注損傷具有明顯的保護作用，其機制與促進內源性H2S生成以保護心肌組織細胞結構、抑制CK、LDH漏出、上調CSE及mRNA表達有關。

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