基于網絡藥理學探討柴胡龍骨牡蠣湯 治療癲癇的作用機制

朱勇 李亮 吳華英 夏帥帥 李豐 黃惠勇 楊萍

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學、生物信息學等方法研究神經遞質參與柴胡龍骨牡蠣湯（CLMD）抗癲癇潛在機制。方法 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）預測、篩選CLMD可能的生物活性成分，并預測其靶點。利用藥物靶點數據庫挖掘癲癇相關靶點，構建CLMD藥效分子-靶點網絡及CLMD藥效分子-癲癇靶點網絡，采用ClueGo 分析CLMD治療癲癇可能的分子機制，使用鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型進行相關機制驗證。結果 從TCMSP中獲得CLMD中活性成分42個及110個藥效分子靶點基因。利用數據庫獲得213個癲癇靶點。CLMD生物活性成分-癲癇靶點網絡構建分析，最終得到CLMD治療癲癇的169個關鍵基因，包括共同靶點11個，分別為：CHRNA2、CYP1A2、CYP3A4等。通路富集分析顯示，這些重要靶點能夠富集到在癲癇發生發展中發揮重要作用的通路上，如GABA-A受體、多巴胺能、谷氨酸能、神經遞質受體等信號通路。動物實驗驗證，CLMD能提高鋰-匹羅卡品癲癇大鼠GABA水平，降低DA水平，保護海馬CA1區神經元細胞。結論 CLMD治療癲癇具有多系統、多成分、多靶點的特點，特別是調整神經遞質代謝水平。

〔關鍵詞〕 癲癇;柴胡龍骨牡蠣湯;網絡藥理學;分子機制;信號通路

〔中圖分類號〕R277.7? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.009

Study on the Mechanism of Chaihu Longgu Muli Decoction in the Treatment of Epilepsy

Based on Network Pharmacology

ZHU Yong1， LI Liang2， WU Huaying2， XIA Shuaishuai2， LI Feng2， HUANG Huiyong2， YANG Ping1*

（1. Neurosurgery Department of Brain Hospital of Hunan Province， Clinical Medical College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Key Laboratory of Hunan Province for TCM Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study potential mechanism of Chaihu Longgu Muli Decoction （CLMD） in the treatment of epilepsy based on network pharmacology， bioinformatics and other methods. Methods Potential bioactive components of CLMD were screened and predicted through Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and their targets were predicted. By using Therapeutic Target Database （TTD）， epilepsy-related targets were mined. CLMD pharmacodynamic molecule-target network and CLMD pharmacodynamic molecule-epileptic target network were constructed. Possible molecular mechanism of CLMD in the treatment of epilepsy was analyzed through ClueGo. Lithium-pilocarpine epilepsy rat model was used to verify the mechanism. Results A total of 42 bioactive components of CLMD and 110 pharmacodynamic molecular target genes were obtained from TCMSP. A total of 213 epileptic targets were screened out through the database. Through CLMD bioactive component-epileptic target network construction analysis， finally， 169 key genes for CLMD treatment of epilepsy were obtained， including 11 common targets： CHRNA2， CYP1A2， CYP3A4， etc. Pathway enrichment analysis showed that these important targets could be enriched in pathways that played an important role in the development of epilepsy， such as GABA-A receptor， dopaminergic， glutamatergic， neurotransmitter receptor and other signaling pathways. Animal experiments showed that CLMD could increase the level of GABA， decrease the level of DA， and protect neurons in hippocampal CA1 area in rats with epilepsy induced by lithium-pilocarpine. Conclusion CLMD has characteristics of multi-system， multi-component， and multi-target in the treatment of epilepsy， and it can especially regulate neurotransmitter metabolic level.

〔Keywords〕 epilepsy; Chaihu Longgu Muli Decoction; network pharmacology; molecular mechanism; signaling pathway

癲癇是一種常見的、持續存在的威脅生命的神經系統疾病，全球約8 000萬人罹患該病，其特征是持久自發性癲癇發作的傾向[1]。研究發現約30%的患者癲癇發作仍未得到控制[2]。因此，開發具有療效好、副作用少的抗癲癇藥物已成研究重點[3]。

現代藥理學發現中藥柴胡龍骨牡蠣湯（CLMD）治療癲癇具有良好的效果[4]。我們前期研究發現，CLMD可通過增加SOD，降低MDA，明顯改善顳葉癲癇患者癥狀[5]。但CLMD為復方制劑，各味中藥中所含成分龐雜，藥效物質基礎和分子機制依然不十分明確。故本研究基于網絡藥理學以及生物信息學方法，擬篩選和預測CLMD治療癲癇的重要活性成分和作用靶點，以及相關的通路，并建立動物模型進行驗證，探討其抗癲癇的作用機制。

1 材料和方法

1.1? CLMD活性成分篩選

將CLMD所有藥物成分通過檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺[6]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP）挖掘CLMD所有成分數據，根據成分藥動學吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數[7]行初步篩選，篩選條件為藥物口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18[8]。

1.2? CLMD作用靶點預測及生物活性成分-靶點網絡構建

預測篩選后的CLMD主要生物活性成分的作用靶點，預測使用TCMSP提供的靶點預測模型。利用網絡繪圖軟件Cytoscape 3.4.0[9]構建CLMD主要生物活性成分-靶點之間的作用網絡。

1.3? 癲癇疾病相關靶點檢索

通過TCMSP、DrugBank[10]、TTD[11]、PharmGKB[12]、 GAD[13]等與疾病靶點相關的數據庫，以“Epilepsy”作為關鍵詞對癲癇相關靶點進行檢索及挑選，獲得癲癇發病過程中已知的靶點。

1.4? CLMD抗癲癇的蛋白質-蛋白質相互關系網絡構建

構建藥物直接靶點與其他蛋白之間的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，用于發掘藥物可能靶點之間的直接、間接調控作用關系。對藥物靶點以及疾病靶點通過蛋白-蛋白相互作用關系數據庫String[14]進行互作分析，篩選條件為互作分數大于700的較強互作關系。對獲得的兩個互作網絡抽取交集的靶點網絡，構建CLMD治療癲癇的直接和間接靶點調控網絡圖。

1.5? 基因通路富集分析

通過基因富集分析插件ClueGO[15]對獲得的藥物/疾病直接互作的關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，研究CLMD抗癲癇可能的作用機制（同種類型的信號通路使用同種顏色的節點，信號通路的顯著程度通過節點的大小表示）。并對上述靶點進行GO通路富集分析，對P<0.05且排名前十的通路構圖并對比分析。

1.6? 動物實驗驗證

30只健康雄性SPF級SD大鼠（許可證編號：SYXK〔湘〕2016-0005）隨機分為對照組，模型組，CLMD低、中、高劑量組，每組6只。除對照組以外均采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型[16]。對照組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。CLMD低、中、高劑量給予CLMD12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg，ig，1次/d，連續28 d。將大鼠麻醉（10%水合氯醛500 mg/kg，ip）后，左心室抽取動脈血5 mL進行ELISA檢測血漿γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）（上海哈靈）水平[17];灌注后取腦采用HE染色檢測海馬CA1區神經元細胞形態[18]。ELISA檢測數據以“x±s”表示，利用SPSS 24.0軟件，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較用LSD-T 檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? CLMD生物活性成分篩選與ADME 分析

本研究在TCMSP 數據庫中檢索到CLMD成分637個，根據DL和OB參數從中挑選，獲得58個CLMD的主要生物活性成分。CLMD及其活性成分見圖1。利用TCMSP提供的藥物成分靶點數據挑選出42個有對應靶點的活性成分。

2.2? CLMD作用靶點預測及生物活性成分-靶點網絡構建

預測上述得到的42個生物活性成分的作用靶點，排除重復靶點后獲得110個成分作用靶點。利用Cytoscape 3.4.0繪制CLMD主要生物活性成分-靶點之間的作用網絡。共獲得619對生物活性成分與對應作用靶點，其中基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2），絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinases14，MAPK14），TP53等靶點也能與多個成分形成作用關系。見圖2。

2.3? 癲癇相關靶點檢索

通過檢索疾病基因相關數據庫，獲得與癲癇發生、發展密切相關的靶點基因共213個，其中TCMSP、PharmGK、TTD、DrugBank、GAD數據庫分別檢索到11、34、23、88、122個靶點。

2.4? CLMD治療癲癇的PPI網絡構建及關鍵靶點篩選

利用數據庫String對癲癇相關的靶點基因進行PPI網絡構建，213個靶點基因中有184個與12 536個靶點之間有相互作用，這些靶點基因與其他靶點之間的相互作用關系多達115 864個。從中篩選了互作分數大于700的PPI。最終獲得183個疾病相關靶點與其他2 374個靶點之間的相互作用關系9 736個。

對CLMD活性成分的作用靶點進行PPI網絡構建可知，在110個藥物靶點基因中有97個與12 841個靶點之間有相互作用，這種作用關系達135 163個。篩選互作分數大于700之后，獲得3 578個互作靶點，相互作用關系達11 623個。

將癲癇靶點網絡和CLMD活性成分靶點網絡相結合，作用靶點取交集后構建CLMD活性成分-癲癇相關基因網絡。該網絡中有1601個節點，相互作用關系13 919個。我們從中篩選出CLMD活性成分靶點和癲癇靶點基因之間有直接相互作用的網絡，得到169個靶點（包括110個癲癇相關靶點，70個藥物作用靶點，共同靶點11個，即CHRNA2、CYP1A2、CYP3A4、GABRA1、GRIA2、GSTM1、IL1B、MAOA、MAOB、OPRM1、SLC6A4）之間的相互作用關系410個。篩選策略圖見圖3。

2.5? CLMD治療癲癇的機制分析

利用ClueGO對上一步篩選得到的169個關鍵靶點基因做KEGG以及GO通路富集分析，KEGG通路富集結果顯示，CLMD治療癲癇的關鍵靶點主要與尼古丁成癮、神經遞質、炎癥、藥物代謝、神經活性配體-受體相互作用等53條相關信號通路（圖4）。GO分子功能通路富集分析顯示這些重要靶點主要分布在一些神經遞質、離子通道相關的通路，而細胞組分通路富集結果顯示它們主要分布在與膜、突觸、通道復合物等相關的通路中（圖5）。

2.6? 各組大鼠血漿GABA、DA測定

與對照組相比，模型組血漿中GABA顯著降低、DA顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，CLMD低、中、高劑量組GABA升高，CLMD高劑量組DA降低（P<0.05或P<0.01）;與CLMD高劑量組相比，CLMD低、中劑量組GABA水平顯著升高，DA降低（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.7? 各組大鼠海馬CA1區神經元細胞結構情況比較

對照組海馬CA1區神經元排列整齊，細胞形態結構完整;模型組海馬CA1區神經元排列疏松，出現細胞腫脹，伴有不同程度的細胞固縮;CLMD各劑量組海馬CA1區神經元細胞形態明顯改善，尤其是CLMD高劑量組（圖6）。

3 討論

癲癇屬中醫學“癇病”范疇，病因主要責之于痰，明·樓英《醫學綱目·癲癇》云“癲癇者，痰邪逆上也”，痰邪貫穿疾病始終，故有“無痰不作癇”之說。治療上當以滌痰開竅，鎮驚安神為主。柴胡加龍骨牡蠣湯（CLMD）出自漢·張仲景《傷寒論》第107條，是柴胡證中和解法的代表方劑之一，具有和解痰瘀，泄熱安神之功。本方柴胡、黃芩主入肝膽清其胸脅之熱，半夏、生姜、茯苓降逆氣化痰濁，桂枝、人參、大棗升中土歸化萬物，龍骨、牡蠣、鉛丹鎮驚安神，大黃下其瘀熱。故清·徐靈胎《傷寒論類方》言：“本方能下肝膽之驚痰，以之治癲癇必效。”

本研究通過初步篩選獲得了62個CLMD的主要生物活性成分，并在此基礎上利用最終得到的42個生物活性成分，繼而挖掘出110個靶點基因以及相互作用關系619個。生物活性成分-靶點網絡分析顯示，CLMD能作用于網絡中的多個靶點， MMP2、MAPK14、TP53等靶點也能與多個成分形成作用關系。然后通過CLMD生物活性成分-癲癇靶點網絡構建分析，得到CLMD治療癲癇的169個關鍵基因（共同靶點11個，即CHRNA2、CYP1A2、CYP3A4、GABRA1、GRIA2、GSTM1、IL1B、MAOA、MAOB、OPRM1、SLC6A4）。因此，CLMD有效成分之間不僅存在緊密的協同關系，而且其作用的靶點也在癲癇疾病進程中發揮著重要作用。

通路富集結果顯示，CLMD主要通過影響尼古丁成癮、神經遞質、炎癥、藥物代謝、神經活性配體-受體相互作用等相關通路而發揮治療癲癇作用。GO分析發現γ-氨基丁酸（GABA）-A受體活性、電壓門控鈣通道、多巴胺能、谷氨酸能等。（1）GABA是一種抑制性的神經遞質，GABA-A受體與癲癇關系最密切，多項實驗證實興奮GABA-A受體能抑制癲癇發作，抑制GABA-A受體則會誘發癲癇[20]。（2）電壓門控鈣通道廣泛分布于中樞神經系統中，其中L型鈣通道可能與癲癇的發生有密切的關系，其阻斷劑維拉帕米通過提高內質網上鈣聯結蛋白的轉運和組裝能力來大幅增強GABA-A受體的α亞基的表達[21]。（3）多巴胺是中樞神經系統的單胺類神經遞質之一， 其中D1類受體可增強興奮性氨基酸神經毒性，降低抑制性神經遞質濃度。同時，可能通過增加Ca2+，從而動作電位后出現持續性去極化狀態，加強癲癇活動[22]。（4）谷氨酸是中樞神經系統主要的興奮性氨基酸神經遞質，其中NMDA受體可直接與離子通道相耦聯，與興奮性氨基酸結合后，引起Ca2+和Na+內流，誘發腦內的異常電活動[22]。目前研究證實，癲癇患者的重要病理學改變為海馬硬化，主要表現為海馬區神經元的丟失和膠質增生并伴有齒狀回顆粒細胞軸突的出芽、神經發生以及炎癥反應[23]。本研究動物實驗發現鋰-匹羅卡品癲癇大鼠海馬CA1區神經元細胞固縮，而CLMD可改善海馬CA1區神經元細胞形態、增加GABA、降低DA，從而保護海馬區神經元細胞。

綜上，基于網絡藥理學、生物信息學分析及實驗驗證揭示出CLMD可能通過神經遞質與離子通道發揮抗癲癇機制，為后續研究及實驗提供重要的理論依據，也為藥物作用機制研究和藥物研發提供了新思路和新方法。

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