HIF-1α經TRAP1調節肝癌細胞HepG2的EMT作用研究

楊 柳，趙英琦，黃曉妍，王夢璇，陳文君，孫 易,呂元明

(桂林醫學院公共衛生學院衛生毒理，廣西桂林 541000)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其全球發病率位居癌癥第6位，肝癌的發生、發展是一個多基因、多途徑、多階段的復雜過程，因此只有深入研究肝癌分子作用機制并從中尋找作用靶點才能達到徹底治愈肝癌的目的[1]。腫瘤壞死因子受體相關蛋白1(TRAP1)是熱休克蛋白90(HSP90)家族的成員之一，在癌癥、神經變性和其他疾病中具有不同的作用[2]。研究表明TRAP1是參與調節癌細胞能量代謝的分子伴侶，在腫瘤細胞的異常增殖、藥物耐受及抗凋亡信號通路活化等方面有著重要的作用。上皮細胞-間充質轉化(EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程[3]，缺氧和EMT都是腫瘤侵襲轉移中的重要事件，缺氧導致的EMT與腫瘤的進展密不可分[4]。本文旨在對正常肝細胞和肝癌細胞中TRAP1的表達水平，以及TRAP1在缺氧誘導因子-1(HIF-1α)觸發的EMT中的作用進行研究，探討HIF-1α是否是經TRAP1調節肝癌的EMT過程。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝癌細胞株 HepG2及人正常肝細胞株 LO2由貴陽醫科大學馬璐教授饋贈；DMEM 高糖培養基(美國Gibco公司)；胰酶(美國Life Technologies公司) ；胎牛血清(美國Sera Pro公司)；小鼠抗β-actin單抗和HRP標記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋)，TRAP1兔抗人多克隆抗體和HRP標記的兔抗鼠IgG(美國Cell Signaling Technology公司)；高靈敏化學發光檢測試劑盒(上海七海復泰公司)；TRizol和 DEPC (美國Invitrogen公司) ；RT-PCR試劑盒(日本TOYOBO公司)，QPCR試劑盒(天根公司)；噻唑藍(MTT)和二甲亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；DAPI(美國Sigma公司)；4%多聚甲醛(美國Solarbio公司)；exa Fluor594-conjugate Goat anti-Rabbit IgG(H+Lp，美國Proteintech公司)；Triton X-100(美國Solarbio公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 肝癌細胞株HepG2和正常肝細胞株LO2，37 ℃、飽和濕度、5%CO2條件下用含10%滅活胎牛血清DMEM高糖培養基培養，每2～3天傳代1次。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2MTT檢測細胞存活率 取對數生長期的HepG2細胞和LO2細胞接種于96孔板，細胞接種密度為1×104/孔，分別培養0、24、48、72、96 h后每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，離心棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩混勻5 min， 使用酶標儀于490 nm波長下檢測各孔吸光度(A)值。每組設5個復孔，實驗重復3 次。根據A值和時間繪出細胞的生長曲線。

1.2.3細胞劃痕實驗 在6孔板中分別接種HepG2細胞和LO2細胞，細胞接種密度為5×105/孔。接種后24 h用移液器槍頭劃痕，使用PBS清洗3～5次，完全除去脫落細胞。隨后加入2 mL基礎培養基，于37 ℃，5%CO2條件下在培養箱內培養。劃痕后0、24、48 h時間點對細胞劃痕結果拍照。ImageJ軟件處理圖片并測量劃痕面積。傷口愈合百分比=(初始劃痕面積-某時間點劃痕面積)/初始劃痕面積。

1.2.4免疫熒光實驗 HepG2和LO2細胞按3×104/孔接種于放有細胞爬片的12孔板，37 ℃，5%CO2培養箱培養24 h，至細胞融合度達到50%。使用4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS清洗5 min×3次。0.2% Triton X-100的PBS溶液通透15 min，PBS清洗5 min×3次后，1%BSA的PBS室溫封閉1 h。使用TRAP1一抗孵育,4 ℃過夜后PBS清洗，二抗Alexa Fluor594室溫避光孵育1 h，PBS清洗。鬼筆環肽Phalloidin-DMSO工作液室溫染色90 min，PBS清洗后，DAPI染色15 min，PBS清洗。取出爬片，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡激發光波長488 nm下觀察拍照。 Image J軟件對圖片進行溶圖和定量分析。

1.2.5Western Blot檢測細胞蛋白表達 取對數生長期HepG2和LO2細胞用胰酶消化，加裂解液裂解細胞，提取總蛋白。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分離并轉膜,5%胎牛血清白蛋白封閉孵育1 h,加入β-actin,TRAP1的一抗，4 ℃孵育過夜后用TBST漂洗3次；二抗37 ℃孵育1 h，TBST 漂洗3次，化學發光，曝光顯影后存取膠片拍照帶并使用Image J軟件進行灰度值分析。

1.2.6實時熒光定量 PCR(RT-qPCR) 取對數生長期 HepG2細胞和LO2細胞經胰酶消化，加入Trizol提取總RNA，反轉錄合成cDNA，進行RT-qPCR檢測。使用Primer 5.0進行引物設計，ABI7500儀器進行檢測。擴增條件為：55 ℃ 10 min、95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s、55.0 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min，共40個循環。GAPDH作為內參照，采用2-ΔΔCt方法分析檢測結果，實驗重復3 次。

表1 TRAP1及GAPDH引物序列

2 結 果

2.1HepG2細胞增殖能力高于LO2MTT實驗結果表明，肝癌細胞株HepG2的增殖能力高于人正常肝細胞株LO2，特別是第5天測得HepG2細胞和LO2細胞的A值分別為1.591±0.036和1.043±0.007，HepG2的活力比LO2高1.525倍(P<0.01)，見圖1。

2.2Hep2的細胞遷移能力高于LO2細胞劃痕實驗表明，LO2和HepG2的24 h傷口愈合百分比統計結果分別為(27.03±0.15)%和(49.68±0.84)%；LO2和HepG2的48 h劃痕面積統計結果分別為(40.55±0.69)%和(70.04±2.27)%。結果表明LO2細胞劃痕愈合速度明顯低于HepG2細胞。與0 h相比，24、48 h的細胞傷口愈合百分比差異有統計學意義(P<0.001)，見圖2。

2.3HepG2中的TRAP1免疫熒光強度高于LO2通過對細胞骨架、細胞核及TRAP1定位免疫熒光染色，發現TRAP1明顯定位于細胞核周圍，并且與正常肝細胞LO2相比，肝癌細胞HepG2內的熒光強度顯著增加，見圖3。

2.4HepG2中TRAP1的蛋白及mRNA表達水平高于LO2在HepG2細胞中，TRAP1在蛋白和mRNA表達水平均高于LO2，其中TRAP1在LO2和HepG的WB灰度定量結果分別為0.591 3±0.008 0和0.728 7±0.005 4，TRAP1在LO2和HepG2細胞中的mRNA水平表達結果分別為1.000±0.000和6.274±0.215，TRAP1在肝癌細胞HepG2中的表達高于在正常肝細胞LO2中的表達，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

A:細胞劃痕實驗圖；B：細胞劃痕愈合能力定量分析圖

圖2 HepG2細胞和LO2細胞在各時間點傷口愈合能力

圖3 TRAP1在HepG2和LO2細胞中的熒光定位(400×)

A：蛋白水平表達圖；B：灰度定量分析圖；C：mRNA水平表達圖

圖4 TRAP1在LO2和HepG2細胞中蛋白及mRNA水平的表達

2.5HepG2和LO2細胞中EMT相關基因表達變化與TRAP1表達關系 與EMT相關基因E-Cadherin在HepG2中的表達低于LO2(P<0.01);Vimentin在HepG2中的表達高于LO2(P<0.01);HIF-1α在HepG2中的表達高于LO2(P<0.01);見圖5、6。

圖5 與EMT相關基因在LO2和HepG2細胞中的表達結果

A:HIF-1α；B：E-cadherin;C:Vimentin

圖6 與EMT相關基因在LO2和HepG2細胞中的表達結果定量分析

3 討 論

本研究使用肝癌細胞HepG2和正常肝細胞LO2對HIF-1α是否經TRAP1調解肝癌的EMT過程進行研究。RT-qPCR、Western Blot及免疫熒光實驗結果均表明，與正常肝細胞LO2相比，在增殖和遷移能力更強的肝癌細胞HepG2細胞中TRAP1表達增加。Western Blot結果表明，與LO2細胞相比，HepG2細胞的TRAP1的表達變化伴有EMT相關基因E-Cadherin表達下調和Vimentin表達上調，同時HIF-1α表達也出現上調。

在EMT過程中，原發灶的癌細胞由靜止的上皮細胞轉變成具有遷移能力的間充質細胞，從而具有了極強的侵襲性。細胞發生EMT之后，形態及生物學行為均發生了改變，在這個過程中鈣黏蛋白中的E-cadherin是發生EMT的生物標志物之一，會隨著EMT的發生而表達下降[5]；同時，細胞骨架成分的Vimentin的增高也伴隨著遷移能力增加，因而兩者常用來標記EMT的發生[6]。缺氧是實體瘤最重要的微環境特點之一，缺氧的微環境促使腫瘤發生一系列的適應性變化，其中就包括腫瘤的侵襲轉移能力增加和EMT過程[5]。缺氧條件下產生的最關鍵的轉錄因子HIF-1具有調節體內的能量代謝，促進血管生成等功能，它可以通過調節相關的轉錄因子(Snail、Slug、Twist、ZEB1、SIP1等)，經轉化生長因子-β(TGF-β)、Notch、Wnt/β-catenin等多個通路來促進腫瘤細胞遷移侵襲能力的增加[7-8]。HIF-1α高表達能引起乳腺癌、胰腺癌、口腔癌和肝細胞癌等多種腫瘤細胞發生EMT特征的轉變，提高其侵襲轉移能力[7,9-10]。TRAP1主要在線粒體內膜上表達，在維持線粒體的完整和功能、調節線粒體凋亡及參與調節線粒體呼吸和能量代謝轉化中具有重要作用[11]。以往研究表明TRAP1的異常表達與多種腫瘤的發生、發展密切相關，在包括結腸癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多種癌癥中表達上調[12]。干預TRAP1功能雖然可導致腫瘤細胞的死亡，但對正常細胞沒有影響。在卵巢癌細胞MCF-7中過表達TRAP1基因可以抑制線粒體有氧呼吸，影響腫瘤細胞能量代謝，調控腫瘤惡性生物學行為[13]。TRAP1過表達與上皮性卵巢癌分化差，國際婦產科聯盟分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，導致其惡性表型的增加[14]。TRAP1的過表達參與結直腸癌的局部浸潤，影響疾病發展和特異性生存。在非小細胞肺癌中，TRAP1表達上調導致該疾病復發風險增加[15-16]。本研究表明在肝癌細胞中，TRAP1高表達與EMT相關基因和HIF-1α表達變化同時存在，這說明TRAP1的變化可能是HIF-1α調節EMT的可能途徑之一。但關于TRAP1在影響HIF-1α調節EMT的具體機制作用還需進行大量的深入研究。

綜上所述，本研究結果初步表明HIF-1α可能是通過上調TRAP1影響肝癌細胞的EMT過程，TRAP1可能是一個潛在的肝癌生物標志物的篩選候選基因。該結果為今后肝癌的精準治療尋找相應的治療靶點提供了相關理論依據。