小桐子Dof基因家族生物信息學與表達分析

唐躍輝 包欣欣 王健 馮荊城 張夢 張慧聰 劉夢蘭 王玉瑾 婁慧敏 閆浩 譚結 王清偉 劉坤

土壤干旱、鹽堿已成為制約中國農作物生長發育的瓶頸，直接關系到中國的國家安全和國民經濟可持續發展，解決這一問題的重要途徑就是大力加強耐逆性相關基因的挖掘及在分子育種中的開發利用研究。其中，分子育種以其年限短、效率高和目的性強等特點受到作物育種學家的高度青睞，是未來作物育種的主要手段。小桐子，又名小油桐、麻瘋樹（Jatropha curca$L.），是大戟科麻瘋樹屬的多年生落葉灌木/小喬木，具有耐土壤瘠薄、耐鹽特別是耐干旱的特性。因此從具有耐受干旱、貧瘠、鹽等特性的小桐子中挖掘耐干旱、耐鹽等高效利用的基因資源，并申請基因專利保護，對農作物耐逆品種培育具有重要的農業價值和應用意義。

Dof蛋白是植物特有的一類轉錄因子，其名稱源于靠近N末端的一段由50個氨基酸組成的高度保守的c2c2鋅指DNA結構域（命名為Dof結構域），該結構域通過結合下游靶基因啟動子區T/AAAAG基序，直接激活這些基因的表達，在植物的生長發育、生物及非生物脅迫響應中起重要的調控作用。相反，Dof蛋白的c末端是非常多變的，該區域包含蛋白質一蛋白質相互作用域和調控基序，如位于擬南芥AtDOF4.2和AtDOF4.4蛋白c末端的Thr-Met-Asp基序，該基序主要負責AtDOF4.2和AtDOF4.4蛋白的轉錄激活能力。根據Dof蛋白全長氨基酸序列的相似性和拓撲結構特征，擬南芥Dof基因家族成員被分成9個組，即A、B1、B2、C1、C2.1、C2.C3、D1、D2和D2。近年來，研究者們對植物尤其是擬南芥和番茄的研究結果表明，Dof轉錄因子對植物的生長發育、初生和次生物質代謝、種子成熟和萌發、抗逆性、植物激素信號轉導等有重要的調控作用，如番茄Dof轉錄因子S1CDFl和S1CDF3通過直接激活脅迫響應基因CORl5、RD29A、RDIO的表達，增加了轉基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的抗性：擬南芥Dof家族基因CDF3是一個正調控因子，過表達CDF3基因推遲了擬南芥的開花時間，增加了擬南芥對干旱和冷脅迫的抗性：ChIP分析顯示，AtDOF5.4/OBP4通過直接抑制下游基因CyclinBl;1、CDKBl;1和XTH的表達，負調控細胞周期進程和細胞生長：AtDOF4.2通過直接激活細胞壁松弛因子AtEXPA9的表達.正調控種子表皮的發育。這些研究結果表明，Dof轉錄因子主要通過調控下游基因的表達，從而影響植物的生長發育進程。目前，隨著全基因組學和轉錄組學測序技術的發展，許多物種Dof轉錄因子已經被鑒定和全基因組分析，如擬南芥、水稻、大白菜、辣椒、番茄等。值得注意的是，關于Dof蛋白的克隆和功能研究主要集中在擬南芥、番茄、水稻等模式植物中，然而，在大戟科物種中尤其在小桐子中鮮有報道。

目前，對大戟科物種Dof家族基因的組織特異性及非生物脅迫條件下的表達模式和功能的研究尚未見報道，因此，進行小桐子Dof轉錄因子家族成員的鑒定、表達模式和全基因組詳細分析尤為必要，且亟需進行?；谛⊥┳尤蚪M測序和不同條件下的表達譜分析結果，篩選并鑒定出小桐子Dof基因家族成員，利用生物信息學和轉錄組學技術，全面分析了小桐子Dof家族成員的保守域、系統發育樹、保守基序、染色體定位，組織特異性表達及非生物脅迫條件下表達模式。該研究結果為進一步研究Dof基因在小桐子生長發育和非生物脅迫響應中的潛在功能提供良好的理論基礎和依據。

1材料和方法

1.1植物材料與脅迫處理

小桐子種子來源于中國貴州省，并種植于中國廣東省廣州市中國科學院華南植物園實驗基地。小桐子干旱、鹽脅迫處理方法參考Tang等進行，脅迫處理后，選取根進行轉錄組測序及qRT-PCR分析，并選取正常生長條件下的根、莖、葉和授粉后14 d和35 d的種子用于組織特異性表達分析，錫箔紙包裹后立即放入-80℃超低溫冰箱保存待用。

1.2 RNA提取

采用美基生物（Magen，http：//www.magentec.com.cn/）植物RNA提取試劑盒（貨號R4152-02）進行小桐子各組織RNA提取，具體的操作方法參考試劑盒說明書中難提抽植物組織總RNA小量抽提進行。采用TaKaRa公司（http：//www.takarabiomed.com.cn/）逆轉錄試劑盒（貨號6210A）進行第一鏈cDNA合成，具體操作方法參考試劑盒說明書進行。

3討論

Dof轉錄因子家族基因在植物的生長、發育和非生物脅迫響應中起重要的調控作用。目前，關于Dof基因克隆及功能的研究主要集中在模式植物中，如擬南芥、番茄等，然而，在非模式植物如小桐子中罕見報道。本研究基于轉錄組測序數據，首次對小桐子Dof基因的組織特異性和非生物脅迫條件下的表達模式進行了全面詳細的分析，總共24個小桐子Dof蛋白被鑒定。與擬南芥（36個Dof蛋白）和水稻（30個Dof蛋白）相比，小桐子包含更少的Dof蛋白，一個可能的解釋是小桐子Dof家族基因沒有經歷大規模的全基因組倍增事件，然而大規模倍增事件導致擬南芥和水稻Dof家族基因的擴大。

大量的研究結果表明，系統發育樹能夠為不同植物同源基因功能的預測提供一些有價值的信息和依據，如擬南芥、小桐子和水稻ERF或WRKY基因家族系統發育樹分析結果表明，位于相同亞組的同源基因在保守基序、表達模式和功能等方面是相對保守的;小桐子JcERF034（JcDREB）和它在擬南芥中的同源基因RAP2.4（ATlG78080）屬于A6亞組，JcERF034和RAP2.4都受干旱脅迫誘導表達，并且在擬南芥中過表達JcERF034或者RAP2.4均增加了轉基因植物對非生物脅迫的抗性[28-29]。因此，我們構建了小桐子、擬南芥和水稻Dof蛋白的系統發育樹，該結果不僅可以表明擬南芥、小桐子和水稻Dof家族蛋白之間的演化關系，而且基于已經鑒定的擬南芥Dof基因的功能，還可以為小桐子中同源Dof基因功能的預測提供依據。AtDOF5.4/OBP4（AT5G60850）和小桐子JcDof11位于A組的同一個分支，AtDOF5.4/OBP4負調控擬南芥細胞周期進程和細胞生長，這些結果表明，JcDofll基因也許參與小桐子細胞周期進程和細胞生長的調控。ATDOF5.8（AT5G66940）、JcDof8和JcDof17都屬于D2組的成員且位于系統發育樹同一分支，ATDOF5.8和JcDof8均響應干旱、鹽脅迫反應且過表達ATDOF5.8增加了轉基因擬南芥對非生物脅迫的抗性，JcDofl7受干旱脅迫誘導表達，這些分析結果表明，JcDof8和JcDofl7也許在小桐子響應非生物脅迫反應中起重要的調控作用?？傊?，系統發育樹能夠提供一些重要的信息，為小桐子Dof基因功能的研究提供有價值的依據。值得注意的是，E組在系統發育樹上形成了一個獨立的分支，且該組包含8個水稻Dof蛋白和1個小桐子Dof蛋白，不包含擬南芥Dof蛋白。該結果表明，E組的Dof蛋白也許是在水稻、擬南芥、小桐子共同祖先的進化過程中，在水稻和小桐子中保存了下來或者是在擬南芥中丟失。

近幾年，越來越多的轉錄因子家族全基因組的研究結果表明，蛋白序列所含有的保守基序或者功能域在相同的組中是高度保守的，如ERF、WRKY等轉錄因子家族。然而這些保守基序和系統發育樹一樣，也能夠為研究未知基因的功能提供一些有價值的信息。在本研究中，大多數在同一組中的小桐子Dof蛋白擁有相似的保守基序。這些結果表明，包含相似保守域的這些Dof蛋白也許在小桐子生長發育中擁有相似的功能，值得我們進一步研究和開發利用。

通常，基因的表達模式往往可以為該基因功能的預測提供一些重要的信息。基于小桐子表達譜數據，我們分析了小桐子Dof基因在根、莖皮層、葉和種子不同發育時期的表達模式。JcDof4在根中表達量最高，其表達模式和它在擬南芥中的同源基因CDF4（AT2G34140）的表達模式是相似的，異位表達CDF4導致根小柱細胞（Columella cells）提前分化，因此，我們推測JcDof4可能參與小桐子根生長與發育的調控。JcDofl3在小桐子種子發育后期表達最高，并且它的同源基因AT3G47500在種子成熟期上調表達，因此我們推測JcDofl3在小桐子種子成熟期可能起重要的調控作用。JcDof7在莖皮層有高的表達，它的同源基因ATlG28310目前還沒有相關的研究報道，說明JcDof7或者ATlG28310也許在植物莖發育與形成中起重要的作用，具體功能還需要進一步驗證。JcDofl4在種子不同發育時期的表達量隨著種子的成熟逐漸增加，且該基因在根、莖皮層和葉中幾乎檢測不到表達，該結果表明JcDofl4基因參與種子不同發育階段的調控。JcDofl4在擬南芥中的同源基因SCAPl（AT5C，65590）通過調控氣孔成熟相關基因的表達，正調控保衛細胞（Guard cell）的分化。前人研究結果表明，Dof基因在植物響應非生物脅迫反應中起重要的調控作用。如在擬南芥中過表達番茄SICDFl基因增加了轉基因植物對鹽和干旱脅迫的抗性：基于轉錄組數據分析結果表明，大多數大白菜和辣椒Oof基因被鹽和干旱誘導表達。本研究中，12個小桐子boy基因響應鹽脅迫反應，10個小桐子Oof基因響應干旱脅迫反應?？傊?，表達譜分析結果表明，小桐子Oof家族大部分基因在小桐子響應非生物脅迫反應中也許起重要的調控作用，它們的功能還需要進一步通過試驗驗證。概括起來，盡管Dof轉錄因子全基因組和表達模式分析不能提供小桐子Oof基因真正的功能，但是小桐子Oof基因表達模式、系統發育樹和保守基序分析可以為這些基因在植物生長發育和非生物脅迫響應中的研究提供有價值的理論基礎和依據。

本研究中，總共24個小桐子Dof蛋白被鑒定。該研究首次全面詳細地分析了小桐子Dof轉錄因子家族基因在正常生長條件和非生物脅迫條件下的表達模式。小桐子，水稻和擬南芥Dof基因系統發育樹和不同條件下的表達模式分析結果為進一步研究Oof基因在小桐子生長發育和非生物脅迫響應中潛在的功能提供有價值的信息，進而促進boy基因在小桐子抗逆分子育種中的應用。