響應面試驗優化飽和水溶液法制備紫蘇精油β-環糊精包合物工藝及其理化性質

方浩標　李春海　張鐘　張玲　熊岑　彭地緯　謝亞水　徐井水

摘要：建立飽和水溶液法制備紫蘇精油β-環糊精（β-CD）包合物的最佳工藝，通過單因素實驗，考察β-CD與紫蘇精油的比值、溫度、時間、超聲時間對紫蘇精油包埋率的影響，采用Box-Behnken實驗設計和響應面分析優化紫蘇精油微膠囊的包埋工藝。結果顯示最佳的包合條件為：β-CD與紫蘇精油比值7：1（g/g）、溫度53°C、時間100min，在此最佳工藝條件下，紫蘇精油β-CD包合物的包埋率約73%。紅外光譜、掃描電鏡和熱重分析證實了紫蘇精油β-CD包合物的形成，為其作為天然抗菌劑和防腐劑應用于食品活性包裝領域提供理論基礎。關鍵詞：紫蘇精油;β-CD包合物;Box-Behnken響應面設計;理化性質

中圖分類號：TB48

文獻標識碼：A

文章編號：1400（2019）01-0047-08

Response Surface Optimization of Preparation of Perilla Oil-Β-Cyclodextrin Inclusion Compound Using Saturated Water Solution Method， And Its Physico- Chemical Properties

FANG Hao-biao， LI Chun-hai， ZHANG Zhong， ZHANG Ling， XIONG Cen， PENG Di-wei， XIE Ya-shui， XU Jing-shui

Abstract： To prepare the β-cyclodextrin （β-CD） inclusion of Perilla oil with a saturated aqueous solution， single factor experiments were used to examine the influence of proportions of wall-to-core ratio， stirring temperature， inclusion time on microencapsulation efficiency. The selected key parameters were optimized using response surface methodology with Box-Behnken experimental design. The results showed that the optimal process parameters were as follows： wall-to-core ratio of 7：1， stirring temperature of 53 °C， inclusion time of 100 min. Under these conditions， the microencapsulation efficiency was approximately 73%. The successful formation of microcapsules of Perilla oil in β-CD was confirmed by Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， scanning electron microscope （SEM） and thermo- gravimetric analysis （TGA）. Therefore， it provided a theoretical basis application in food active packaging of Perilla oil.

Keywords： Perilla oil; β-CD inclusion compound; Box-Behnken response surface design; physicochemical properties

紫蘇精油（Perillaoil）多是從紫蘇的葉子和籽中提取的一種揮發性活性精油，具有多種功能如抗氧化、抗菌、抗病毒、殺蟲的功效等[1-3]。紫蘇精油作為天然抗氧化劑現已成為國內外科研領域的研究熱點，廣泛用于食品工業、醫藥、包裝材料等工業原料的供應，具有重大的科研價值[4-6]。然而，紫蘇精油也存在較多不足，如強揮發性、光敏感性、易降解性且極易被氧化性，在生產與運輸過程中易發生損失，這些限制了其在食品包裝、農業及其它領域的應用[7-8]。為此，利用包合物緩釋技術，形成有效的調控釋放系統，提高精油的穩定性[9-10]。

β-環糊精（Cycolodextrin，β-CD）常用的壁材物質，與精油分子形成包合物[11]，這是因為以下幾方面原因;首先，β-CD空腔是疏水的，精油分子的非極性越高，越易被其它包合;其次，當疏水親脂的精油分子進入β-CD空腔后，其疏水基團與β-CD空腔接觸最大，然而其親水基團卻遠離空腔;另外，β-CD孔徑大小不同，能分別選擇容納體積大小與其空腔相匹配的精油分子，這樣形成的包合物較穩定[12-13]。本研究擬采用飽和水溶液法制備紫蘇精油β-CD包合物，并進行一系列單因素實驗和響應面實驗來優化包合工藝，實現有效延緩紫蘇精油的揮發、延長精油的緩釋效果。因此，紫蘇精油包合物可以作為抗菌劑和防腐劑應用于生物基可降解活性食品包裝領域中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇精油，天津百世化工有限公司;β-環糊精（β-CD，壁材），河南雙騰實業有限公司;無水乙醇（分析純），天津市百世化工有限公司，等。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計，上海儀電科學儀器股份有限公司;傅里葉紅外光譜儀（FTIR），美國電熱公司;掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會社;超聲波清洗器，德國Elma公司;TGAI型熱重分析儀，瑞士梅特勒公司，等。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫蘇精油β-CD微膠囊的制備

參考林玉環等[14]適當修改后，采用飽和水溶液法來制備紫蘇精油β-CD包合物。稱取適量β-CD倒入燒杯內，加入一定量的蒸餾水，在恒溫油浴鍋中攪拌溶解至溶液由乳白色剛好變為澄清為止，為β-CD的飽和溶液。取1g的紫蘇精油，在一定溫度條件下，將其逐滴加入到飽和溶液中，待出現渾濁且有白色沉淀出現時，繼續攪拌至規定時間，停止加熱，繼續攪拌至室溫。將其放置在4°C冰箱冷藏24h，待β-CD包合物充分析出，抽濾，濾渣用蒸餾水和無水乙醇分別洗滌3次，洗去吸附在β-CD空腔外部的紫蘇精油和未包埋的β-CD，然后于50°C真空干燥箱至恒重，得紫蘇精油β-CD包合物。

1.3.2 包合物的效果評價

1.3.2.1 紫蘇精油的標準曲線制作[15]

精確稱取10mg紫蘇精油標準品，于100mL容量瓶中用無水乙醇溶解，稀釋適當倍數，以無水乙醇為空白，在200～400nm波長范圍掃描，確定最大吸收波長204nm處。精確量取一定紫蘇精油標準液，用無水乙醇稀釋為質量濃度分別為1、3、5、7、9μg/mL的標準溶液，于204nm波長處測定吸光度，并以吸光度為縱坐標（Y）、紫蘇精油標準溶液質量濃度為橫坐標（X），得到標準曲線為y=4.62x+0.1314，R2=0.9978（n=5）。

1.3.2.2 紫蘇精油含量測定

精確稱取20mg包合物品于潔凈干燥的稱量紙上，將其轉移至50mL的容量瓶內，用無水乙醇定容至刻度線，搖勻，通過預實驗發現制得的包合物產品于超聲45min，紫蘇精油的浸出效果最佳。將50mL容量瓶超聲45min。震蕩結束后搖勻，從容量瓶內取適量的混合液于離心管內，在3500r/min和25°C下高速離心15min。倒出適量上清液并測出其在最大吸收波長（204nm）下的吸光值。最后根據繪制出的標準曲線，計算包合物中紫蘇精油的含量。

1.3.3 單因素實驗與因素水平選擇

（1）壁芯比對包埋效果的影響，固定包合溫度為60°C、攪拌時間為1h，設置芯壁材比分別為4：1、6：1、8：1、10：1、12：1，考察不同壁芯比對包合物包埋率的影響。

（2）溫度對包埋效果的影響，固定壁芯比為8：1、攪拌時間為1.5h，設置包合溫度分別為40、50、60、70、80°C，考察不同溫度對包合物包埋率的影響。

（3）攪拌時間對包埋效果的影響，固定壁芯比為8：1、包合溫度為60°C，設置攪拌時間分別為30、60、90、120、150min，考察不同攪拌時間對包合物包埋率的影響。

1.3.4 響應面試驗

在單因素實驗基礎上，采用Design-ExpertV8.06軟件，根據Box-Behnken實驗設計原理，選擇對包合物包埋率影響顯著的壁芯比（A）、包合溫度

（C）、包合時間（B）為自變量，以包埋率為響應值，篩選紫蘇精油β-CD包合物最佳工藝參數，實驗因素與水平設計見表1。

1.3.5 表征方法

制備樣品的理化性質表征采用掃描電鏡、傅里葉紅外光譜儀、激光粒度分析儀和熱重分析儀對其進行表征。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 芯壁材比對包埋效果的影響

考察因素如壁芯比、包合溫度和包合時間對β-CD紫蘇精油包合物包合率的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，飽和水溶液法制備紫蘇精油β-CD包容物單因素分析結果顯示，β-CD與紫蘇精油質量比8：1;包合溫度應控制在60°C;包合時間為90min左右最佳。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

基于單因素試驗結果，選擇對包埋率影響顯著的壁芯比（A）、包合時間（B）、包合溫度（C）為自變量，以包埋率為響應值，設計了三因素三水平響應面分析試驗，試驗方案及結果見表2，采用Design-ExpertV8.06軟件對試驗數據進行二次響應面回歸分析，得到的包合物包埋率與各因變量的模擬方程為：

Y=72.54-139·A+0.23·B-2.85·C+0.72·A·B+1.48·A·C+0.53·B·C-2.31·A2-2.15·B2-2.65·C2。

2.2.2 響應面方差分析結果

方差分析見表3，該模型的P<0.01，說明該二次方程模型為極顯著。決定系數為R2=0.9152，說明該回歸模型的擬合情況較好，回歸方程代表性較好，其響應值的變化有91.52%來自于所選的變量;模型調整系數（RAdj2）為0.8061，表明該回歸模型的擬合情況良好，實際值與預測值較為接近;模型精密度為7.919，>4，說明該模型是可行的，其可靠性可通過方差分析及相關系數來考察[16]。從回歸方程各項的方差分析結果還可看出方程的失擬項P值為0.0913，不顯著，表明該方程對試驗擬合程度好、誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析和預測，因此將該模型適于飽和水溶液法制備紫蘇精油β-CD包合物工藝參數優化。

由表3中F值的大小可判斷各因素對包合物包埋率影響的強弱，F值越大，對包埋率影響作用越強[17]。各個因素對紫蘇精油β-CD包合物包埋率的影響程度大小的次序為包合溫度（C）>壁芯比（A）>包合時間（B）。其中C、C2對包埋率的影響極顯著（P<0.01）;A、A2、B2對包埋率的影響顯著（P<0.05）。

2.2.3 響應面分析

紫蘇精油β-CD包合物包合響應面（圖4）可直觀的反映出，壁芯比和包合溫度對包合物包埋率的影響顯著。在包合溫度和包合時間不變的條件下，隨著壁芯比的增加，包埋率先上升后趨向平緩。在壁芯比和包合時間不變的情況下，包埋率先隨著包合溫度的增大而升高，達60°C后包埋率升高不顯著。當壁芯比和包合溫度不變時，隨著包合時間的增加，包埋率先升高后下降，90min達最大值。根據等高線圖可知，壁芯比和包合溫度的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著;壁芯比和包合時間、包合溫度和包合時間的等高線圖接近圓形，說明其交互作用均不顯著。

通過回歸模型預測的包合物包合制備最優條件：β-CD：紫蘇精油比值為6.75：1，包合溫度52.98°C，包合時間99.07min，包埋率預測值為73.49%。為了便于操作最優條件修正為β-CD：紫蘇精油比值為7：1，包合溫度53°C，包合時間100min，在此條件下。在此條件下做6組驗證實驗，β-CD對紫蘇精油的包埋率達73.24%±0.50，與預測值相差不大，標準差為0.34%，模型真實可靠。

2.3 理化表征

2.3.1 表觀形貌分析

采用掃描電鏡對β-CD和最佳水平下制得的包合物的表面形貌進行掃描，掃描如圖3。

由圖3可見，β-CD外形為斜菱形，顆粒大小不均且分布散亂，表面沒有破裂，也沒有明顯的折皺;然而，由β-CD與紫蘇精油形成的包合物晶體的SEM圖可見，包合物顆粒大小趨于均勻，聚集性更強，表面開始出現了皺褶和凹痕，這使得它與混溶體系中的其他物質分子進行碰撞時，能夠產生一定的包埋作用。對比圖3（a-b）形貌變化，預示著紫蘇精油已被β-CD包埋。

2.3.2 FTIR分析

紫蘇精油、β-CD及它們的包合物FTIR結果如圖4所示。

從圖4（a）和圖4（c）可知，紫蘇精油原本在3010cm-1，1747cm-1和1463cm-1的特征吸收峰在包合物中出現位移，且2855cm-1，1747cm-1處的峰值強度減弱。然而，圖4（b）和圖4（c）中，在3387cm-1，1417cm-1，1154cm-1，1031cm-1包合物和β-CD均有吸收峰，峰形相同;但兩者之間的吸收峰也存在差異，1640cm-1出吸收峰發生了位移。結果顯示：紫蘇精油-β-CD包合物成功合成。

2.3.3 粒徑分析

使用激光粒度分析儀對優選制備的紫蘇精油-β-CD包合物進行粒徑分析，結果如圖5。

由圖5可以看出紫蘇精油-β-CD包合物的粒徑呈現一種正態分布，粒徑分布主要集中在80～90μm，平均粒徑約為86μm，這與SEM圖片中的尺寸基本相符。

2.3.4 TG分析

熱重分析儀對β-CD和制備得到的紫蘇精油包合物進行熱重分析，TG曲線見圖6所示。

由圖6（a）可知，β-CD有兩個失重階段，β-CD第一階段是從30°C到終止溫度111°C，失重率為12.56%，此階段為自由水的蒸發階段;第二階段是從313°C到終止溫度346°C，失重率達到61.54%。圖6（b）可見，包合物的失重同樣分為兩個階段，分別為30～107°C和306～335°C，失重率分別為11.13%和47.68%。包合物在第一階段的失水程度略微弱于β-CD，因為β-CD與紫蘇精油的疏水相互作用使得β-CD內腔失去了部分結晶水。第二階段為壁材熱分解階段，失去壁材的保護后，紫蘇精油也在此階段開始揮發損失。結果顯示：包合作用提高了紫蘇精油的熱穩定性。

3 結論

本實驗選用β-CD與紫蘇精油為原料，采用Box-Behnken實驗設計和響應面分析優化紫蘇精油-β-CD包合物微膠囊的包埋工藝。結果顯示：最佳的包合條件為：β-CD與紫蘇精油比值7：1（g/g）、溫度53°C、時間100min，在最佳工藝條件下，紫蘇精油β-CD包合物的包埋率約73%，FTIR證實紫蘇精油被成功包合在β-CD中。包合物的粒徑分布集中在80～90μm;SEM顯示包合物趨于均勻，表面開始出現了皺褶和凹痕;TG結果表明β-CD與紫蘇精油的相互作用使得體系的熱穩定性提高，降低了紫蘇精油的揮發損失。如此，為紫蘇精油-β-CD包合物作為天然抗氧化劑應用于食品活性包裝領域提供理論依據。

參考文獻：

[1]薛山.紫蘇精油的研究新趨勢[J].中國食品添加劑，2011，01：199～204.

[2] Scapin G， R.Abaide E， F.Martins R. Quality of perilla oil （Perilla frutescens） extracted with compressed CO2 and LPG [J]. J Super Fluid， 2017， 130：176～182.

[3] Yu H， Qiu JF， Ma LJ， et al. Phytochemical and phytopharmacological review of Perilla frutescens L. （Labiatae）， a traditional edible-medicinal herb in China [J]. Food and Chemical Toxicology， 2017， 108：375～391.

[4]邵平，洪臺，何晉浙，等.紫蘇精油主要成分季節性變化分析及其干燥方法研究[J].中國食品學報，2012，9：216～221.

[5] Ide T， Tanaka A. α-Lipoic acid ameliorated oxidative stress induced by perilla oil， but the combination of these dietary factors was ineffective to cause marked deceases in serum lipid levels in rats [J]. Nutrition Research， 2017， 48：49～64.

[6]王素君，張良曉，李培武，等.紫蘇籽油抗菌活性研究

[J].中國食品與營養，2017，23（11）：38～42.[7]王建，薛山，趙國華，等.紫蘇不同部位精油成分及體外抗氧化能力的比較研究[J].食品科學，2013，7：86～91.

[8] Li HZ， Zhang ZJ， Hou TY， et al. Optimization of ultrasound-assisted hexane extraction of perilla oil using response surface methodology [J]. Industrial Crops and Products， 2015， （76）：18～24.

[9]王素君，張良曉，李培武，等.紫蘇籽油抗菌活性研究[J].中國食物與營養，2017，23（11）：38～41.

[10] Rodrigues LB， Brito AO， Martins PB， et al. Anti- inflammatory activity of the essential oil obtained from Ocimum basilicum complexed with β-cyclodextrin （β- CD） in mice [J]. Food and Chemical Toxicology， 2017， 109： 836～846.

[11]童林薈.環糊精化學[M].北京：科學出版社，2001，p10～11.

[12]張雯文，馬建武，任和，等.環糊精包合技術及在食品工業中的應用進展[J].食品工業，2014，35（09）：256～260.

[13]RenXL， YueSL， XiangH， XieMC.Inclusioncomplexesofeucalyptusessentialoilwithβ-cyclodextrin： preparation， characterizationandcontrolledrelease[J].J.PorousMater， 2018， 25：1577～1586.

[14]林玉環，高昆，況鵬群，等.金銀花精油及其與β-環糊精包合物的制備工藝研究[J].安徽農業科學，2017，45（05）：67～69.[15]廖霞，楊小蘭，李瑤，等.響應面試驗優化復凝聚發制備槲皮素微膠囊工藝及其理化性質[J].食品科學，2016，37（22）：20～28.

[16]韓愛芝，蔣卉，賈清華，等.響應面實驗優化黑果枸杞花生苷微膠囊制備工藝及其穩定性分析[J].食品科學，2016，37（10）：82～86.

[17]徐蓉蓉，高垚垚，周云龍，等.薏苡仁油β-環糊精包合物的制備及其表征[J].食品工藝科技，2017，12：258～263.