漢中地區(qū)羊肚菌人工栽培菌種初步選育研究*

趙航軻 ，彭 浩 **，盧雨欣

（1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西 漢中 723000）

羊肚菌屬于真菌子囊真菌，是世界四大珍貴食用菌之一[1]。其富含多種氨基酸，9種為人體必需氨基酸，約占氨基酸總含量的40%[2]，而且24.5%的蛋白質，具有很高的營養(yǎng)價值[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖和蛋白質[4]，具有抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗氧化和降低膽固醇等重要活性，對抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)具有重要意義。

羊肚菌生長環(huán)境要求較為特殊，子實體形成困難且產量不穩(wěn)定。關于羊肚菌最早栽培的記載為1883年，之后的100多年有許多關于羊肚菌栽培出菇的報道[5-8]。自1982年羊肚菌室內人工栽培成功以來，世界各地相關研究人員都在羊肚菌人工栽培技術上不斷突破更新[9-10]。從羊肚菌的制種、栽培環(huán)境、外援營養(yǎng)等生產宏觀角度以及從分子生物學水平研究羊肚菌代謝機理等生物學微觀角度多方面研究，不斷優(yōu)化羊肚菌人工栽培技術。近年來，國內羊肚菌人工栽培發(fā)展迅速，栽培面積不斷增大，市場交易量日益增加[11]。但對羊肚菌人工栽培技術尚未完全突破，而實現(xiàn)羊肚菌商業(yè)化栽培最重要的是成熟穩(wěn)定的菌種和良好的栽培環(huán)境[12-13]。

漢中市位于陜西的中南部，屬北亞熱帶內陸性季風氣候，陽光充足，溫度適宜，降雨較多，空氣濕度大，雨季一般在9月份[14]。漢中市地處秦巴山區(qū)，食（藥）用菌種類多，自然條件適宜野生食用菌的生長，據相關文獻報道，秦巴山區(qū)分布有一百余種野生食藥用菌[15]。羊肚菌屬偏低溫高濕型菌類，在形成原基與子實體時需要大量水分，因此在漢中地區(qū)進行羊肚菌的人工栽培具有先天的自然優(yōu)勢。

通過對漢中各地區(qū)采集野生及試栽羊肚菌菌株進行試驗室分離、純化、鑒定、制種及人工栽培，經初篩、復篩及中試試驗不斷進行人工馴化，初步確定適合漢中人工栽培的羊肚菌菌種，為漢中地區(qū)羊肚菌高產穩(wěn)產的商業(yè)化栽培奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

供試菌株由陜西省食藥用菌工程技術研究中心從各地區(qū)收集的野生及試栽羊肚菌，經試驗室分離純化制備菌種，采集地點、形態(tài)描述、菌種編號見表1。

表1 野生羊肚菌信息匯總Tab.1 Summary of wild Morchella

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂18 g、維生素B110mg，純化水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離純化

將采集的羊肚菌子實體用自來水輕輕沖洗，去除表面附著的泥沙，用滅菌后脫脂棉蘸取75%的乙醇對子實體進行5次表面消毒，用無菌水沖洗5次，去除殘留乙醇，將羊肚菌子實體放至裝有0.1%的升汞溶液的燒杯中浸泡45 s，取出用無菌水沖洗5次，濾紙充分吸干表面水分，打開鼓風紫外線消毒15min，用無菌操作從菌蓋和菌柄結合處切取0.5 mm2塊莖，接種至加入抗生素的基礎培養(yǎng)基中，并對接種的菌種不斷進行轉接純化， 純化后置于4℃冰箱保存。

菌株鑒定：將純化好的羊肚菌接種于PDA培養(yǎng)基中進行形態(tài)學觀察，采用插片法觀察其菌絲顯微形態(tài)，有無分支和菌絲橫隔，結合相關參考文獻進行初步鑒定。利用 CTAB法提取羊肚菌菌絲體 DNA，真菌引物（ITS 1/ITS 4）進行 PCR 擴增。擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。所得序列在 NCBI 中進行比對分析，結合形態(tài)學進行種屬鑒定。

1.2.2 菌種制備

原種制備：菌種活化后，制備液體種，170 r·min-1、24℃培養(yǎng)10 d，制備原種。

原種培養(yǎng)基：采用5種培養(yǎng)基制備原種，如表2所示。含水量55%～65%，121℃滅菌4 h晾涼后，無菌接種，至24℃恒溫避光培養(yǎng)25 d，以菌絲生長速度、菌核數(shù)量、菌絲致密度為標準篩選最佳原種培養(yǎng)基。

表2 原種培養(yǎng)基組成成分Tab.2 Composition of primary medium

栽培種制備：通過原種培養(yǎng)基篩選，將5種長勢良好的原種培養(yǎng)基作為栽培種培養(yǎng)基，見表3。通過滿袋時間、菌絲致密度、菌核質量選取最終最適栽培種培養(yǎng)基。

表3 栽培種培養(yǎng)基篩選Tab.3 Selection of cultivated species components

1.2.3 栽培地點選擇，拱棚搭建及土壤處理

選址和建棚：選擇土質疏松、富含腐殖質，pH為5～7，含沙量為15%，噴水及排水良的土壤，建立5 m× 20 m× 2.5 m 規(guī)格拱棚，選擇透光度為70%左右的遮蔭網進行搭建。搭建遮蔭棚要注意牢固，大棚四周用薄膜覆蓋，棚內面積約為50 m2。注意留有通風口，以保證通風良好。

建畦及開廂：將土壤中的一切雜物去除掉。在處理過的地畦上均勻撒生石灰來消毒。每個大棚內兩畦，每畦用工具開播深10 cm、寬15 cm的溝槽，約30 m2，每個菌種栽培兩畦。使用生石灰消毒（22.5 g·m-2）后，再進行松土和整地，松土深度為25 cm左右。開廂操作和松土是同步進行的。廂高一般為20 cm左右，寬度約1.2 m，兩廂之間需要有廂溝，廂溝用來排水和人員通行。廂溝一般寬0.4 m、深0.25 m左右。

1.2.4 播種及外援營養(yǎng)

選擇10月下旬至11月下旬進行播種，溫度為4℃～18℃。播種：將所有用具嚴格滅菌，以防止菌種污染。將長勢良好、生命力強、無雜菌污染的栽培種掰成2 cm～4 cm的碎塊，均勻撒在之前做好的溝槽內，然后在菌絲上覆蓋厚5 cm的土層。在播種后10 d～15 d左右，擱置營養(yǎng)袋以補充營養(yǎng)成分。在營養(yǎng)袋上劃出10 cm左右的口，將劃開口的一側緊貼菌床橫放，或在營養(yǎng)袋一側均勻扎孔，將扎一側緊貼菌床放置，施加密度為3 袋/m2～4 袋/m2。為防止雜菌污染，擱置30 d后，除去營養(yǎng)袋。

1.2.5 出菇管理及采摘

濕度控制：羊肚菌出菇時對水分要求高，此時土壤含水量應提高到70%并保持在一定水平。羊肚菌出菇后應減少土壤含水量，控制在40%～50%，空氣濕度保持在55%～90%。

溫度控制：出菇棚內應維持在10℃～15℃。出菇后溫度應控制在25℃以下，溫度過高會灼傷羊肚菌子實體，影響產量。棚內溫度過高時應及時通風降溫，必要時掀開薄膜大棚，搭建雙重以上遮陽網。

光照控制：羊肚菌出菇階段應減少光照。大棚增加遮蔭網以降低透光度至20%左右。

羊肚菌的采收：羊肚菌出菇速度快，采收時間也很短。一般羊肚菌出菇10 d后進行羊肚菌采集。羊肚菌脊棱即將破損的時候及時采收。采集羊肚菌時，用刀在羊肚菌子實體菌柄與土壤相接處平割，勿傷原基。將羊肚菌子實體的形態(tài)特征及產量進行詳細記錄，初步篩選出其中產量高、品質好的菌株。

1.2.6 復篩試驗

2016年～ 2017年，在漢中市武鄉(xiāng)鎮(zhèn)進行栽培試驗，分別在林下和大棚進行對比，根據初篩菌絲萌發(fā)時間、菌霜期出現(xiàn)時間以及子實體品質和產量，對栽培方式進行優(yōu)化，結果表明，羊肚菌最適栽培方式是棚內栽培， 便于調整土壤及空氣溫度、濕度。同時，在播種前對菌種添加拌菌劑，可以為菌種提供一定的營養(yǎng)物質和菌種播種初保持一定濕度。每個菌種做3個重復，每個重復栽培面積為30 m2，詳細記錄子實體的產量及品質，進一步篩選出其中產量高品質好的菌株進行下一階段中試試驗。

1.2.7 中試試驗

2017年～ 2018年，在漢中武鄉(xiāng)鎮(zhèn)進行栽培試驗。營養(yǎng)方式及出菇管理根據復篩進行優(yōu)化。根據觀察，菌絲不能完全利用營養(yǎng)袋，采取縮小體積營養(yǎng)袋、增大單位面積營養(yǎng)袋數(shù)量的方式，菌絲可以充分利用營養(yǎng)袋，即在播種后10 d～15 d左右，施加營養(yǎng)袋為4 袋 /m2～6 袋 /m2， 同時在菌絲萌發(fā)后，當氣溫達到零度以下，菌霜不能及時出現(xiàn)，在地畦表面覆蓋黑地膜，保持地畦表面土壤溫濕度，確保菌絲生長活力。每個菌種做3個重復，每個重復栽培面積為100 m2。

1.2.8 部分地區(qū)推廣試驗

2018年以來，在漢中市武鄉(xiāng)、南鄭、城固縣等羊肚菌栽培基地對篩選出的羊肚菌進行示范推廣。

2 結果與分析

2.1 初篩試驗結果與分析

對野生羊肚菌進行分離純化和鑒定后，優(yōu)化制備栽培種培養(yǎng)基組分為木屑20.0%、谷殼25.0%、小麥32.0%、麩皮10.0%、腐殖土10.0%、生石灰1.5%、石膏 1.5%，播種后 LU-01、LU-02、LU-03、LB-01、NZ-01、NZ-02、NZ-03未出菇，其他羊肚菌菌株子實體出菇產量相對較高，篩選試驗見表4。

表4 羊肚菌栽培初篩試驗結果Tab.4 Results of Morchella cultivation preliminary screening test

由表4可知，篩選出MX-02、MX-03、MX-04、LB-01、LB-02、LB-03、CG-01 7個為較優(yōu)菌株。

2.2 復篩試驗結果與分析

LB-01、CG-01幾乎未出菇，LB-02出菇少，即表明以上菌株穩(wěn)定性低，抗逆性差，不能進行后續(xù)試驗，MX-02、MX-03、MX-04、LB-03 4株羊肚菌出菇產量較高、品質較好，見表5。

表5 羊肚菌栽培復篩試驗結果Tab.5 Results of Morchella cultivation rescreen test

由表5可知，說明這幾株菌具有人工馴化的可能性，可以進行下一步中試試驗。

2.3 中試試驗結果與分析

根據初篩復篩對試驗過程中播種前菌種預處理及播種后棚內保溫保濕相關技術改進，進行中試試驗，見表6。

表6 羊肚菌栽培中試試驗結果Tab.6 Experimental results of Morchella cultivation

由表6可知，MX-02、MX-04、LB-03均能穩(wěn)定出菇， 且子實體形態(tài)穩(wěn)定， 畸形菇較少，產量較高。

2.4 推廣試驗結果與分析

將試驗篩選出的MX-02、MX-04、LB-03在漢中市武鄉(xiāng)鎮(zhèn)、城固縣、南鄭縣進行初步推廣，其中在武鄉(xiāng)推廣的MX-02平均產量為2 481 kg·hm-2、MX-04平均產量為2 652 kg·hm-2、LB-03平均產量為2 151 kg·hm-2，在南鄭推廣的MX-02平均產量為2 227.5 kg·hm-2、LB-03 平均產量為 2 272.5 kg·hm-2，在城固推廣的MX-04平均產量為1 882.5 kg·hm-2。

3 結語

試驗通過收集漢中市各地區(qū)野生及試栽羊肚菌子實體進行分離純化和鑒定，將純化后的菌種進行初篩、復篩、中試試驗篩選出穩(wěn)定性和抗逆性較強的羊肚菌菌種。通過播種前將菌種揉碎后添加拌種劑，為菌絲提供一定的含水量及營養(yǎng)物質。營養(yǎng)袋施加過程中通過縮小營養(yǎng)袋體積而增大單位面積施加量，使菌絲能夠充分利用營養(yǎng)。出菇管理過程中由于低溫造成結霜未及時出現(xiàn)，采用覆膜等方式及時進行保溫、保濕等相關技術改進，使羊肚菌產量和性狀維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。最終得到3株優(yōu)勢較強的羊肚菌，其中MX-02和MX-04為六妹羊肚菌，LB-03為梯棱羊肚菌，為漢中地區(qū)羊肚菌的商業(yè)化栽培奠定理論基礎。