9 種常見(jiàn)野生食用菌總黃酮的提取鑒定分析*

龍 華，劉 斌，李政東

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

黃酮類化合物是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，能將活潑、有害的自由基還原為穩(wěn)定且無(wú)害的產(chǎn)物，有效地清除體內(nèi)的自由基。黃酮類化合物種類繁多，存在于植物體中具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病等多重藥理作用[1]。故其作為新藥研究開發(fā)的先導(dǎo)化合物，是一個(gè)值得重視的資源，具有重要的現(xiàn)實(shí)研究意義。食用菌含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、膳食纖維、不飽和脂肪酸、核苷、礦物元素及黃酮類、酚類等多種生理活性物質(zhì)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和重要的醫(yī)療保健功能[2]。近年來(lái)，以食用菌為原料提取黃酮類化合物的研究成為近期營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域最重要、最具意義的研究課題之一[3]，而野生食用菌作為我國(guó)特色高營(yíng)養(yǎng)食物，具有重要的研究?jī)r(jià)值。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)野生食用菌黃酮類化合物的研究較少，多為人工菌、單一或少數(shù)幾種菌類的黃酮提取工藝研究[4-10]。本試驗(yàn)采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法分析了9種常見(jiàn)野生食用菌的總黃酮含量，通過(guò)顯色反應(yīng)對(duì)黃酮的結(jié)構(gòu)種類進(jìn)行初步推測(cè)，對(duì)比性較高，對(duì)分析或食用野生菌具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器試劑

選取市面常見(jiàn)的9種野生食用菌，分別是干巴菌（Thelephora ganbajun）、珊瑚菌（Ramaria aurea）、紅汁乳菇（Lactarius hatsudake）、桃紅牛肝菌（BoletusregiusKrombh）、 雞菌（Termitornyces albuminosus）、雞油菌（Cantharellus cibarius）、正紅菇（Russula vinosa）、白禿馬勃（Calvatia candida）和青頭菌（Russula virescens）。將整株菌子實(shí)體除去泥土等雜質(zhì)，放入烘箱60℃干燥，粉碎，過(guò)200目篩，密封保存，備用。

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、無(wú)水三氯化鐵、濃硫酸、氨水、亞硝酸鈉、硝酸鋁，以上試劑均為分析純。

電子天平（CP214型），購(gòu)自上海奧豪斯儀器有限公司； 超聲波清洗機(jī)（JW-100S型），購(gòu)自東莞市潔美清洗機(jī)設(shè)備有限公司； 分光光度計(jì)（UV-2550型），購(gòu)自島津。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，用60%乙醇溶解并定容至25 mL得蘆丁標(biāo)液（0.20 mg·mL-1）。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取1.00 mL蘆丁標(biāo)液于10 mL的容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；再加5%的NaOH溶液4.0 mL，搖勻， 最后用60%乙醇定容到刻度，混勻，放置10 min，于350 nm～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of rutin

由圖1可知蘆丁在507 nm處顯示最大吸收，確定后續(xù)檢測(cè)波長(zhǎng)為507 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按一定梯度準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL，分別置于10 mL容量瓶中，按1.2.2項(xiàng)中進(jìn)行操作，于507 nm處測(cè)定吸光度值。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.010 8X+0.000 7，相關(guān)系數(shù)為0.999，表明線性關(guān)系良好。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

1.2.4 總黃酮提取液的制備及含量測(cè)定

稱取1.00 g食用菌樣品于100 mL錐形瓶?jī)?nèi)，緩慢加入60%乙醇50 mL，60℃超聲提取40 min，趁熱抽濾，將濾液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，用60%乙醇定容，即為食用菌黃酮提取液。

準(zhǔn)確移取黃酮提取液2.00 mL于10 mL容量瓶，同1.2.2項(xiàng)中進(jìn)行操作，計(jì)算出樣品中的總黃酮含量。總黃酮含量（W，mg·g-1）計(jì)算公式為：

式中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算所得總黃酮濃度(μg·mL-1)；V表示提取液原液體積（50 mL）；m表示樣品質(zhì)量（g）；n表示稀釋倍數(shù)。

1.2.5 樣品中黃酮類化合物的定性分析

黃酮類化合物的顏色反應(yīng)多與分子中的酚羥基及γ-吡喃酮環(huán)有關(guān)。三氯化鐵水溶液或醇溶液為常用的酚類顯色劑，多數(shù)黃酮類化合物因分子中含有酚羥基故可產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，但一般僅在含有氫鍵締合的酚羥基時(shí)，才呈現(xiàn)明顯反應(yīng)； 黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基，顯酸性，可溶于堿性NaOH溶液，其中黃酮類遇堿顯橙色，查爾酮、橙酮類顯紅色、紫紅色，二氫黃酮類顯深紅色，黃酮醇類顯黃色、棕色； 7-吡喃環(huán)上的1位氧原子因有未共用電子對(duì)，表現(xiàn)微弱的堿性，可與強(qiáng)無(wú)機(jī)酸如濃硫酸反應(yīng)生成特殊顏色的鹽；二氫黃酮類易在堿液中開環(huán)，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的異構(gòu)體，查耳酮類化合物顯橙至黃色； 黃酮類化合物當(dāng)分子中有鄰二酚羥基取代或3, 4-二羥基取代時(shí)，在堿液中不穩(wěn)定，易被氧化，產(chǎn)生黃色、深紅色、綠棕色沉淀[11-12]。

鑒于以上原理，分別移取黃酮提取液各2 mL于4支試管中，分別加入少量3%三氯化鐵、5%氫氧化鈉、氨水和濃硫酸，以原提取液作為對(duì)照，觀察各試管的顏色變化，作初步的定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種野生食用菌中總黃酮的含量分析

9種野生食用菌總黃酮含量，見(jiàn)表1。

表1 9種野生食用菌總黃酮含量Tab.1 Total flavonoids content of 9 species of wild edible fungi

由表1可知，分析的9種野生食用菌中均含有黃酮類化合物，干巴菌的總黃酮含量最高，達(dá)6.47 mg·kg-1，紅汁乳菇總黃酮含量最低，為0.62mg·kg-1，總黃酮含量從高到低依次是干巴菌、桃紅牛肝菌、珊瑚菌、白禿馬勃、正紅菇、雞菌、青頭菌、雞油菌、紅汁乳菇。

2.2 9種野生食用菌中黃酮類化合物的定性分析

9種野生食用菌中黃酮類化合物的定性分析，見(jiàn)表2。

表2 野生食用菌中黃酮類化合物的定性分析Tab.2 Qualitative analysis of flavonoids in wild edible fungi

由表1可知，9種野生食用菌提取物中均含有黃酮類化合物。其中干巴菌中可能有黃酮類、黃酮醇； 紅汁乳菇中可能有黃酮醇； 珊瑚菌中可能有黃酮類、查耳酮類和橙酮類； 桃紅牛肝中可能有黃酮類、二氫黃酮類、黃酮醇； 雞菌、雞油菌中可能有黃酮醇和查耳酮類； 正紅菇中可能有黃酮類、查耳酮類和黃酮醇類； 白禿馬勃、青頭菌中可能有黃酮類、黃酮醇類和查耳酮類。

3 結(jié)論

得出9種食用菌的黃酮含量存在顯著差異，含量由高到低依次是干巴菌、桃紅牛肝、珊瑚菌、白禿馬勃、正紅菇、雞菌、青頭菌、雞油菌和紅汁乳菇；其中干巴菌的黃酮含量在9種食用菌中含量最高。由于黃酮類化合物能夠抑制自由基的生成，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，干巴菌可作為后續(xù)菌類開發(fā)抗氧化功能食品的首選。