廣東地區(qū)結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥的pncA、rpsA 、panD基因分型特征研究

關(guān) 平

(廣州市胸科醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510095)

結(jié)核桿菌感染是結(jié)核病的病因，近年來，由于抗結(jié)核治療不規(guī)范，多重耐藥結(jié)核桿菌逐漸增多，給結(jié)核病的防治造成了很大的麻煩[1]。抗結(jié)核治療中，吡嗪酰胺是必不可少的一種藥物，但目前發(fā)現(xiàn)，有很多結(jié)核病患者分離出的菌株中存在吡嗪酰胺耐藥[2]。既往研究提示，吡嗪酰胺耐藥結(jié)核菌株與結(jié)核桿菌中某些基因的突變存在一定關(guān)系，如pncA、rpsA、panD等，但亦有研究指出上述基因突變存在一定的地域特征[3]。因此，筆者就廣東地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因分型特征進(jìn)行研究，以期尋找適合廣東地區(qū)吡嗪酰胺耐藥結(jié)核菌治療的研究方向。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2015年12月至2018年2月在本院就診的327例結(jié)核病患者的痰液標(biāo)本，并統(tǒng)計患者入院時一線藥敏結(jié)果，其中多重耐藥菌(MDR)94株，非MDR 233株。本次研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1痰液樣本收集 患者晨起后，用清水漱口，囑患者用力咳出肺部深部的痰液，收集于無菌樣本保存管中密封。若痰液標(biāo)本為膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質(zhì)的痰液，痰液體積3.0～5.0 mL，則認(rèn)為收集的痰液合格；若不合格，則第2天再次按上述方法收集痰液。所采集到的樣本儲存于4 ℃中，24 h內(nèi)進(jìn)行基因型檢測。

1.2.2結(jié)核分枝桿菌核酸檢測 采用由上海仁度生物科技有限公司提供的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增)檢測痰液標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的基因型。取收集的痰液1.5 mL，加入3.0 mL的4% NaOH，渦旋震蕩1 min后，室溫孵育15～20 min。取1.0 mL液化后的痰液標(biāo)本于樣品處理管內(nèi)，以13 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL生理鹽水重懸，再次離心棄上清，加入50 μL稀釋液重懸后為待測樣品。將2 μL陽性對照或陰性對照加入198 μL稀釋液中，混勻備用。將50 μL待測樣品或陰性、陽性對照，以300 W超聲處理15 min，取2 μL處理后液體加入含有30 μL擴增檢測的微量反應(yīng)管中，將反應(yīng)管置于熱恒溫器上60 ℃保溫10 min，再將反應(yīng)管移至恒溫混勻儀42 ℃保溫5 min后，將預(yù)熱的10 μL酶液加入反應(yīng)管內(nèi)，以1 200 r/min震蕩15 s混勻混合液。將反應(yīng)管放入ABI7500實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。反應(yīng)程序設(shè)定為：熒光素通道設(shè)定為FAM，42 ℃ 1 min，40個循環(huán)，每分鐘收集1次熒光信號，共檢測40次。實驗結(jié)束后將反應(yīng)管直接浸泡于10% 84消毒液中，嚴(yán)禁打開反應(yīng)管，實驗完成后需用10% 84消毒液清潔工作區(qū)和用具。當(dāng)陰性對照dt值無數(shù)值或為40，而陽性對照dt≤35時，說明本批次實驗質(zhì)量可，所得結(jié)果可信。當(dāng)檢測樣品dt≤35時為樣品陽性，檢測樣品dt無數(shù)值或為40時為樣品陰性；對樣品dt>35～<40的樣品進(jìn)行重測，當(dāng)檢驗結(jié)果dt<40，則樣品陽性。

1.2.3吡嗪酰胺藥敏測定 采用Bactectm MGIT 960 全自動分枝桿菌檢測，按照標(biāo)準(zhǔn)操作手冊，液體培養(yǎng)基為pH=5.9 Middlebrook 7H9，其中吡嗪酰胺含量為100 μg/mL，測定吡嗪酰胺藥敏結(jié)果。

1.2.4結(jié)核分枝桿菌基因測序 采用由廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司提供的磁珠法痰液DNA提取試劑盒，根據(jù)公司提供的說明書，從患者痰液樣品中提取DNA。將合格的DNA樣品進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為KAPA HiFi Hot Start Ready Mix (Kapa Biosystems) 25 μL,DNA 模版1 μL，引物各1 μL(10 mmol/L)，水23 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s,62 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min延伸。擴增pncA、rpsA、panD基因所用的引物序列見表1。PCR產(chǎn)物采用Cycle pure kit(Omega)進(jìn)行純化后送華大基因公司進(jìn)行Sanger測序。測序結(jié)果采用Clustalx和DANstar進(jìn)行分析。

表1 pncA、rpsA 、panD基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1痰液結(jié)核分枝桿菌核酸檢測情況及吡嗪酰胺耐藥情況 本研究共收集327份結(jié)核患者痰液標(biāo)本，經(jīng)結(jié)核分枝桿菌核酸檢測，317份痰液標(biāo)本為陽性，陽性率為96.94%。根據(jù)吡嗪酰胺耐藥結(jié)果，327株分離株中吡嗪酰胺耐藥102株，吡嗪酰胺敏感225株，耐藥率為31.19%。其中，MDR菌株的吡嗪酰胺耐藥率為58.51%，而非MDR菌株的吡嗪酰胺耐藥率為20.17%，MDR菌株的吡嗪酰胺耐藥率顯著高于非MDR菌株(P<0.05)。見表2。

表2 吡嗪酰胺藥敏檢測結(jié)果

2.2pncA突變情況分析 225株吡嗪酰胺敏感株中未發(fā)現(xiàn)pncA突變，102株吡嗪酰胺耐藥株中有67株發(fā)現(xiàn)pncA基因突變，突變率為65.69%。55例吡嗪酰胺耐藥的MDR菌株中，發(fā)現(xiàn)pnaA突變有45例，顯著高于吡嗪酰胺耐藥的非MDR菌株pncA基因突變率22/47(χ2=13.781，P=0.000)。見表3。

表3 吡嗪酰胺耐藥的MDR菌株的pncA基因突變情況

續(xù)表3 吡嗪酰胺耐藥的MDR菌株的pncA基因突變情況

注：-表示無氨基酸位點

2.3rpsA突變情況分析 102株吡嗪酰胺耐藥株中檢測出5株rpsA突變，突變率為4.90%；225株吡嗪酰胺敏感株中檢測出1株rpsA突變，突變率為0.44%。吡嗪酰胺耐藥菌株的rpsA突變率顯著高于吡嗪酰胺敏感菌株(χ2=7.476，P=0.006)。見表4。

表4 吡嗪酰胺耐藥菌株的rpsA基因突變情況

注：-表示無氨基酸位點

2.4panD突變情況分析 105株吡嗪酰胺耐藥株中檢測到1株panD突變，為G419→A突變，突變率為0.95%。吡嗪酰胺敏感株中未檢測到panD突變。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各個器官，以肺結(jié)核最為常見。而我國的結(jié)核病患者例數(shù)位于全世界第2，結(jié)核病對國家衛(wèi)生和社會經(jīng)濟都造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[4]。由于藥物使用不規(guī)范或其他原因，近年來多重耐藥性結(jié)核桿菌的發(fā)病率越來越高，增加了結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率[5]。目前，檢驗科多采用細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏試驗，耗時較長，無法讓患者得到及時的治療。因此，通過深入了解結(jié)核分枝桿菌基因組和耐藥的分子機制，尋找更為快速的、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核分子桿菌和藥敏檢測的方式是十分必要和緊迫的。

吡嗪酰胺能夠滲透入吞噬細(xì)胞后進(jìn)入結(jié)核桿菌菌內(nèi)，使其內(nèi)在的酰胺酶脫去酰胺基，轉(zhuǎn)化為吡嗪酸而發(fā)揮抗菌作用，此外，吡嗪酰胺還能取代煙酰胺阻止脫氫作用，妨礙結(jié)核桿菌對氧的利用，影響細(xì)菌的正常代謝，造成細(xì)菌死亡[6-7]。該藥在抗結(jié)核治療中起到了無可代替的作用。但近年來的研究顯示，對MDR結(jié)核桿菌吡嗪酰胺的耐藥率較高，顯著高于非MDR結(jié)核桿菌的吡嗪酰胺耐藥率[8]，與本研究的結(jié)果相近。國內(nèi)外的研究報道提示，吡嗪酰胺耐藥性的產(chǎn)生與pncA突變造成吡嗪酰胺活性降低有關(guān)[9]。本研究收集廣東地區(qū)結(jié)核病患者的樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)吡嗪酰胺耐藥株中pncA的基因突變率為65.69%，略低于國內(nèi)報道的80.00%左右的基因突變率[10]，這一結(jié)果提示pncA基因突變存在一定的地區(qū)差異及在特定地區(qū)調(diào)查pncA基因突變的必要性。有研究指出，吡嗪酰胺耐藥的pncA基因突變位點較為集中，與吡嗪酰胺二級結(jié)構(gòu)的酶活性位點、結(jié)合位點等有關(guān)[11]。但本研究中，pncA基因突變位點未見明顯的聚集，這提示吡嗪酰胺耐藥可能存在未知的分子機制，或吡嗪酰胺存在未知的結(jié)構(gòu)變化。

除了pncA基因，rpsA和panD基因也與吡嗪酰胺耐藥存在很大的關(guān)系[12]。本研究中檢測到5株rpsA基因突變和1株panD基因突變的吡嗪酰胺耐藥菌株。本研究中檢測到rpsA基因突變有部分位點與既往的報道相似，但也有部分位點與既往的報道不同，提示rpsA基因突變也可能存在地域特征[13-14]。而本研究中檢測到1株panD基因突變，G419→A，與國內(nèi)的報道相似[15]，提示panD基因與panA、rpsA基因不同，panD基因的保守性更強，可能作為治療結(jié)核桿菌，特別是吡嗪酰胺耐藥性結(jié)核桿菌的治療靶點。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在中國廣東地區(qū)，結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥率較高，其中pncA基因突變較多，突變位點較為分散；而吡嗪酰胺耐藥結(jié)核分枝桿菌中rpsA基因突變和panD基因突變均值得進(jìn)一步關(guān)注。本研究揭示了我國廣東地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因分型特征，為臨床治療用藥提供了參考依據(jù)。