PRA法檢測hsp65和groES在非結核分枝桿菌肺病診斷中的價值

章 潔，郭秋萍

(廣元市第三人民醫院檢驗科，四川廣元 628001)

我國非結核分枝桿菌肺病的發病率逐年上升，而結核病的比例卻逐年下降[1]。Meta分析顯示，我國以鳥-胞內分枝桿菌復合體肺病最為常見[2]。如今，根據抗酸桿菌涂片的結核分枝桿菌實驗室診斷可在24 h內產生結果[3]。然而，涂片對結核分枝桿菌不是非常特異，并且每毫升痰需要103～104個菌[4]。SAIFI等[5]通過PCR-限制性片段長度多態性分析(PRA)法對分枝桿菌擴增hsp65基因后使用BstEⅡ消化發現，結核分枝桿菌只能產生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非結核分枝桿菌則產生多種片段。ARAVINDHAN等[6]研究發現，結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的groES基因擴增后用BstNⅠ消化產生片段不同。本研究采用PRA法對hsp65和groES進行檢測，以評估其對非結核分枝桿菌肺病的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年2月本院收治的非結核分枝桿菌肺病患者30例作為肺病組，男18例，女12例，平均年齡(41±16)歲。選擇結核病患者30例作為結核組，男14例，女16例，平均年齡(39±18)歲；其中HIV/AIDS合并結核病患者13例，非HIV/AIDS合并結核病患者17例；肺結核病11例，肺外結核病19例。病理科按照中華醫學會結核病分會的標準進行診斷，30例非結核分枝桿菌肺病患者和結核病患者均確診[7-8]。選擇非結核分枝桿菌病感染患者30例作為感染組，男15例，女15例，平均年齡(37±13)歲；經皮膚試驗陽性但無非結核分枝桿菌入侵組織和器官的現象。另選擇2017年6月至2018年2月本院體檢健康者30例作為健康對照組，男15例，女15例，平均年齡(45±14)歲。4組研究者年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有均衡可比性。本研究經本院倫理委員會批準，且受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1痰液中DNA的提取 收集肺病組、結核組和健康體檢組受試者清晨痰液樣本各5 mL，采用支氣管鏡采樣。使用最終1%濃度的NaOH通過Nacl-NaOH方法隔天對樣本凈化15 min。去污后，所有標本均為用磷酸鹽緩沖液中和，并以4 000×g離心15 min。將離心后得到的沉淀物重新懸浮于2 mL LJ培養基中，37 ℃培養過夜后(培養2次均為同一致病菌且抗酸桿菌涂片陽性度為++以上)，使用廈門慧嘉生物科技有限公司的Amresco基因組DNA提取試劑盒(貨號：K368-50RXN)進行DNA的抽取。

1.2.2PCR試驗 PCR的最終體積為25 μL，由5 μL DNA，200 μmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)，每種引物25 pmol，1.5 mmol/L MgCl2,1.25 U Taq DNA聚合酶(眾紅生物，貨號：ZHR1007M)組成，加入10×PCR緩沖液后將反應混合物在94 ℃下初始變性5 min，然后進行35個擴增循環(94 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s和72 ℃ 60 s)。最終延伸在72 ℃下進行10 min。PCR引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3DNA酶消化 采用BstE Ⅱ(NEB，貨號：R0162L)對hsp65基因的擴增產物進行消化，BstN Ⅰ(NEB，貨號：R0168L)對groES基因的擴增產物進行消化。將消化的產物在3%瓊脂糖凝膠電泳上，100 V下進行2 h。擴增hsp65基因后使用BstEⅡ消化發現結核分枝桿菌只能產生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非結核分枝桿菌則產生多種片段(245 bp/220 bp,245 bp/120 bp/100 bp,325 bp/120 bp)[5]。擴增groES基因后使用BstN Ⅰ消化發現結核分枝桿菌能產生多種片段(550 bp/50 bp,470 bp/80 bp/50 bp,310 bp/140 bp/50 bp)，而非結核分枝桿菌則只能產生500 bp/100 bp的片段[6]。基于此，使用Image J軟件對瓊脂糖凝膠成像圖中的條帶進行灰度值分析。條帶數據化后，將[(325 bp+220 bp+100 bp)/80 bp]定義為非結核分枝桿菌hsp65相對分子質量，將(50 bp/100 bp)定義為非結核分枝桿菌groES相對分子質量。

2 結 果

2.14組受試者痰液中hsp65和groES的相對分子質量 肺病組患者痰液中hsp65和groES的相對分子質量明顯高于結核組、感染組及健康對照組(P<0.05)。健康對照組中hsp65和groES的相對分子質量明顯低于感染組、結核組(P<0.05)。感染組患者痰液中hsp65和groES的相對分子質量明顯高于結核組(P<0.05)。見表2。

2.2肺病組與結核組患者痰液中hsp65和groES的診斷效能 繪制30例非結核分枝桿菌肺病患者與30例結核病患者的ROC曲線，見圖1。hsp65的ROC曲線下面積為0.92(95%CI：0.851 4～0.986 4)，以hsp65=2.83為陽性臨界值，其診斷靈敏度為93%，特異度為80%。groES的ROC曲線下面積為0.91(95%CI：0.830 4～0.987 4)，以groES=2.67為陽性臨界值，其診斷靈敏度為77%，特異度為90%。見表3。

表2 4組受試者痰液中hsp65和groES的相對分子質量

注：與結核組、感染組及健康對照組比較，▲P<0.05；與感染組及結核組比較，*P<0.05；與結核組比較：△P<0.05

圖 肺病組與結核組患者痰液中hsp65和groES的ROC曲線

檢測變量靈敏度(%)特異度(%)臨界值曲線下面積P95%CIHsp6593802.830.92<0.000 10.851 4～0.986 4groES77902.670.91<0.000 10.830 4～0.987 4

2.3肺病組與感染組患者痰液中hsp65和groES的診斷效能 繪制30例非結核分枝桿菌肺病患者與30例非結核分枝桿菌感染患者的ROC曲線，見圖2。hsp65的ROC曲線下面積為0.73(95%CI：0.609 3～0.859 5)，以hsp65=3.17為陽性臨界值，其診斷靈敏度為77%，特異度為63%；groES的ROC曲線下面積為0.72(95%CI：0.580 1～0.862 1)，以groES=2.96為陽性臨界值，其診斷靈敏度為77%，特異度為96%。見表4。

2.4肺病組與健康對照組痰液中hsp65和groES的診斷效能 繪制30例非結核分枝桿菌肺病患者與30例體檢健康者的ROC曲線，見圖3。hsp65的ROC曲線下面積為0.90(95%CI：0.831 3～0.982 1)，以hsp65=2.27為陽性臨界值，其診斷靈敏度為93%，特異度為83%。groES的ROC曲線下面積為0.89(95%CI：0.815 7～0.979 8)，以groES=1.96為陽性臨界值，其診斷靈敏度為76%，特異度為87%。見表5。

圖2 肺病組與感染組患者痰液中hsp65和groES的ROC曲線

檢測變量靈敏度(%)特異度(%)臨界值曲線下面積P95%CIHsp6577633.190.730.001 80.609 3～0.859 5groES63962.960.720.003 30.580 1～0.862 1

圖3 肺病組與健康對照組痰液中hsp65和groES的ROC曲線

檢測變量靈敏度(%)特異度(%)臨界值曲線下面積P95%CIHsp6593832.270.90<0.000 10.831 3～0.982 1groES76871.960.89<0.000 10.815 7～0.979 8

3 討 論

世界各地醫院均報道過與被污染的器械有關的非結核分枝桿菌感染暴發[9]。皮膚和免疫抑制患者的非結核分枝桿菌很容易向肺部或淋巴結系統擴散[10]。自20世紀80年代以來，非結核分枝桿菌疾病模式和流行病學已發生變化，并逐漸出現在未被認識的人群中[11]。 非結核分枝桿菌越來越被認為是重要的人類病原體，由于艾滋病和其他免疫缺陷疾病，非結核分枝桿菌引起的疾病流行正在上升，且物種逐漸多樣化[12]。非結核分枝桿菌與結核分枝桿菌復合體成員的區別在于它們不是專性病原體[13]。雖然抗酸桿菌涂片能夠在24 h內診斷出結核分枝桿菌，但是涂片對結核分枝桿菌不是非常特異，并且每毫升痰需要103～104個菌[3-4]。另一方面，隨著全世界非結核分枝桿菌感染頻率的增加，臨床醫生對非結核分枝桿菌疾病的認識提高，導致對非結核分枝桿菌感染的診斷有更多要求[14]。已有研究報道使用PRA法可以區分4種M.chelonae、M.fortuitum、M.kansasii和M.scrofluaceum，它們是臨床上最重要的非結核分枝桿菌[15]。盡管目前發現有154種非結核分枝桿菌，但是除了這4種非結核分枝桿菌，其他非結核分枝桿菌在臨床上并不常見或致病性低。由于PRA法診斷的快速性、便捷性和普遍性，本研究忽略PRA法檢測到其他非結核分枝桿菌的DNA片段。基于此，本研究發現，PRA法檢測hsp65和groES在非結核分枝桿菌病診斷中的臨界值分別為2.27和1.96，且具有較好的效果。

編碼10×103(GroES)和60×103(GroEL)熱休克蛋白的groESL操縱子在細菌中普遍存在并且在進化上保守[16]。分枝桿菌的Hsp65(GroEL2)基因因其在物種鑒定中的實用性而得到充分證明[17]。 Hsp10(groES)基因(Rv3418c)因具有高度保守的氨基酸序列，已鑒定出免疫顯性物種特異性T細胞和B細胞表位并已用于免疫診斷[18]。本研究中使用了439和600 bp的靶DNA序列，發現肺病組患者痰液中hsp65和groES相對分子質量明顯高于結核組、感染組及健康對照組(P<0.05)。439 bp 的hsp65基因和600 bp的groES基因標記是特異性的[19]，具有更廣譜的檢測，可從所有分枝桿菌(包括非結核和非致病)物種中擴增，擴增hsp65基因后使用BstEⅡ消化發現結核分枝桿菌只能產生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非結核分枝桿菌則產生多種片段(245 bp/220 bp,245 bp/120 bp/100 bp,325 bp/120 bp)[5]。擴增groES基因后使用BstN Ⅰ消化發現結核分枝桿菌能產生多種片段(550 bp/50 bp,470 bp/80 bp/50 bp,310 bp/140 bp/50 bp)，而非結核分枝桿菌則只能產生(500 bp/100 bp)[6]。肺病組與結核組的hsp65和groES的靈敏度分別為93%和77%，特異度分別為80%和90%；肺病組與感染組的hsp65和groES的靈敏度分別為77%和63%，特異度分別為63%和96%；肺病組與健康對照組的hsp65和groES的靈敏度分別為93%和76%，特異度分別為83%和87%。

4 結 論

PRA法檢測hsp65和groES在非結核分枝桿菌肺病診斷中具有較好的效果。