不同血脂水平下血清拉曼光譜特征及其對高脂血癥的預(yù)測價值

楊春英，楊 梅，周 冰，周 燕，熊麗娟，崔麗麗，主 勁，曹永芬

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，貴州貴陽 550001)

拉曼光譜檢測是一種利用單色光照射在樣品上產(chǎn)生非彈性散射信號并將該非彈性散射用于物質(zhì)分析的手段[1-2]。拉曼光譜可以根據(jù)分子的轉(zhuǎn)動能級或振動能級以確定分子結(jié)構(gòu)，是一種振動的分子光譜[3]。隨著該技術(shù)的發(fā)展，它被廣泛地運用在生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、材料、鑒偽、考古等領(lǐng)域[4]。它具有準(zhǔn)確度高，速度快，樣品不需前處理或僅僅需要很少的前處理，檢測水溶液樣品無損傷的優(yōu)點，是一種簡便、快捷的技術(shù)[5-6]。本文探討拉曼光譜對人體血清的檢測，探究不同血脂水平下檢測血清拉曼光譜特征及其對高脂血癥的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年8月至2018年3月于本院就診的血脂異常患者50例以及同齡健康者(對照)50例進(jìn)行研究。本次試驗每例樣本檢測4次，進(jìn)行均一化處理。以50例血脂異常樣本為對象進(jìn)行研究，其中男28例，女22例；年齡52～70歲，平均(61.26±9.62)歲；吸煙史14例(28%)；平均收縮壓為(123.59±21.13)mm Hg，平均舒張壓為(78.26±11.36)mm Hg，平均脈搏為(83.69±7.12)2次/min；患者的病史類型中高血壓病史24例(48.00%)，糖尿病病史16例(32.00%)，冠心病病史9例(18.00%)。血脂異常患者和健康者年齡、性別、病史等一般資料比較見表1。檢測血脂異常，利用拉曼光譜分析建立PLS數(shù)學(xué)模型預(yù)測結(jié)果精度，進(jìn)行拉曼光譜譜線分析，統(tǒng)計分析診斷靈敏度、特異度。為防止食物對血液成分造成的干擾，樣本在早飯前采集。先對患者進(jìn)行抽血取樣并分離血清樣本，立刻分別冷藏存放于透明的玻璃樣品器皿中，存放溫度為-80 ℃，存放時間15 d內(nèi)。本研究在得到患者及家屬知情并簽訂同意書情況下進(jìn)行，本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)實施。

表1 兩組一般資料比較

1.2試驗方法 激發(fā)光采用Ar+激光器發(fā)出激光。采用波長精度±0.01 nm的雙光柵單色儀。一個斬波器(700 Hz)和鎖相放大器被用來放大拉曼信號，拉曼信號由PMT探測并傳入計算機中。波長532 nm，采集時間20 s，采集次數(shù)1次，光譜范圍800～1 800/cm，光柵1 800 gr/mm，10倍物鏡，50%的激光功率。光譜測量時，于單色儀和斬波器之間使用約1 mL的血清樣本裝入試管中。所得光譜導(dǎo)入origin-Pro8.0分析軟件進(jìn)行分析，用origin-Pro8.0對測得的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行導(dǎo)入分析，接著通過加和平均的方式得出最后的拉曼光譜數(shù)據(jù)。

1.3高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn) 主要依據(jù)血清中總膽固醇(TC)、總蛋白(TP)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、葡萄糖(GLU)及三酰甘油(TG)的檢測情況，可將高脂血癥分為高三酰甘油血癥、高膽固醇血癥、低高密度脂蛋白血癥、混合型高脂血癥[7-8]。

2 結(jié) 果

2.1血清拉曼光譜分析結(jié)果PLS建模預(yù)測均方根誤差(RMSEP)值和相關(guān)系數(shù)比較 選擇常用的血清成分進(jìn)行拉曼光譜分析，并通過PLS建模的方法預(yù)測RMSEP值和相關(guān)系數(shù)。兩組TC、TP、LDL、VLDL、GLU及TG PLS建模的方法預(yù)測RMSEP值和相關(guān)系數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 血清拉曼光譜分析結(jié)果PLS建模預(yù)測RMSEP值和相關(guān)系數(shù)比較

2.2光譜圖 原始光譜圖見圖1，歸一化處理后的光譜圖見圖2，健康者樣本與血脂異常樣本歸一化處理后的對比圖見圖3。健康者血清樣本與血脂異常血清樣本的拉曼光譜形狀和趨勢非常相似，在拉曼位移約1 001、1 153、1 514/cm處有3個主要的拉曼特征峰，并且熒光背景幾乎相同。血脂異常樣本的特征峰相較于健康者樣本的拉曼位移在949、1 001、1 153、1 347、1 514、1 577、1 611/cm處有些偏移。在1 001、1 153、1 447、1 514、1 656/cm處，血脂異常的峰強顯著高于健康者樣本。血脂異常的樣本在拉曼位移1 261/cm和1 282/cm處有較弱的特征峰出現(xiàn)。見圖3、表3。之后，進(jìn)行了主成分分析,對健康者樣本和血脂異常樣本進(jìn)行區(qū)分，準(zhǔn)確率達(dá)到80%以上，但仍不能完全區(qū)分開來，見圖4。

圖1 原始拉曼光譜(拉曼位移范圍800～1 800/cm)

圖2 歸一化之后拉曼光譜圖

健康者樣本拉曼位移(/cm)相對強度血脂異常樣本拉曼位移(/cm)相對強度特征峰歸屬956.280.042949.750.048酪氨酸、苯1 005.010.1081 001.770.124苯丙氨酸1 155.220.3171 153.640.375β-胡蘿卜素1 212.260.0621 212.260.051酪氨酸、苯丙氨酸、酰胺Ⅲ無1 261.530.039磷脂,酰胺Ⅲ無1 282.600.029酰胺Ⅲ、α-螺旋1 343.050.0381 347.620.028C-H伸縮、色氨酸、腺嘌呤、α螺旋、磷脂1 447.410.0511 447.410.059磷脂、C-H scissor in CH21 517.370.2721 514.410.370β-胡蘿卜素1 582.040.0521 577.650.073蛋白質(zhì)、酰胺、α螺旋、磷脂1 616.970.0481 611.170.070酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸1 656.000.0621 656.000.091酰胺I、α-螺旋、磷脂

圖3 健康者血清拉曼光譜與血脂異常拉曼光譜對比圖

圖4 主成分分析圖

3 討 論

高脂血癥已成為中老年人最常見的疾病之一[10]。高脂血癥又稱為高脂蛋白血癥，是一個慣用的概念[11]，主要特征包括血漿中的TG、膽固醇和LDL的升高及GDL的降低4種血脂代謝紊亂[12-13]。根據(jù)血液生化檢查的結(jié)果，臨床上將高脂血癥可簡單的分為4類:高膽固醇血癥、高三酰甘油血癥、低高密度脂蛋白血癥、混合型高脂血癥。根據(jù)脂蛋白代謝紊亂的原因分類可分為原發(fā)性和繼發(fā)性2種[14]。血脂異常本身沒有太多的臨床表現(xiàn)，主要包括沉積在眼部和真皮內(nèi)等位置的脂質(zhì)可引起的黃色瘤、角膜環(huán)、高脂血癥眼底改變等[15]。明顯的高三酰甘油血癥可以引起急性胰腺炎[16]。血脂異常主要危害患者的心血管系統(tǒng)，在血管內(nèi)皮沉積的脂質(zhì)會導(dǎo)致動脈粥樣硬化，從而引起腦血管疾病、冠心病和外周血管病等[17]。因此，血脂異常的防治不可忽視，需要引起廣泛的重視[18]。

拉曼光譜是一種振動的分子光譜，可以根據(jù)分子振動的能級來確定分子的結(jié)構(gòu)。單色光入射后，光子與分子相互作用，出現(xiàn)彈性和非彈性碰撞2種情況[19]。彈性碰撞即是光子和分子相互作用時沒有能量交換，頻率沒有發(fā)生改變，運動方向發(fā)生改變，也稱為瑞利散射。非彈性碰撞是指光子與分子作用時不僅可以進(jìn)行能量的交換，還可以改變運動方向，從而改變光子的入射頻率，也稱為拉曼散射[20]。

本研究檢測血脂異常樣本50例，對照健康者樣本50例。每例樣本檢測4次，進(jìn)行均一化處理。健康者血清樣本與血脂異常血清樣本的拉曼光譜形狀和趨勢非常相似，在拉曼位移約1 001、1 153、1 514/cm處有3個主要的拉曼特征峰，并且熒光背景幾乎相同。血脂異常樣本的特征峰相較于健康者樣本的拉曼位移在949、1 001、1 153、13 47、1 514、1 577、1 611/cm處有些偏移。在1 001、1 153、1 447、1 514、1 656/cm處，血脂異常的峰強顯著高于健康者樣本。血脂異常的樣本在拉曼位移1 261/cm和1 282/cm處有較弱的特征峰出現(xiàn)。之后，進(jìn)行主成分分析,對健康者樣本和血脂異常樣本進(jìn)行區(qū)分，準(zhǔn)確率達(dá)到80%以上，但仍不能完全區(qū)分開來。猜測可能原因:(1)樣本的個體差異。(2)因為所測得光譜的主要特征峰為1 153/cm和1 514/cm處，其歸屬于β-胡蘿卜素，這2處的特征峰不止受到血脂的影響，已知的多種疾病(腫瘤、乳腺癌等)也在這2處的特征峰處有別于健康者的光譜圖，所以導(dǎo)致了樣本不能完全區(qū)分開來。

4 結(jié) 論

在拉曼位移1 001、1 153、1 447、1 514、1 656/cm處，異常血脂的患者拉曼光譜峰強顯著高于健康者樣本，可以通過對人群的選擇性的幾處拉曼光譜的檢測，來進(jìn)行高脂血癥的診斷和預(yù)測，從而研究其對于高脂血癥的預(yù)測價值。采用拉曼光譜技術(shù),能夠在不同拉曼位移的光譜峰強檢測出健康者和血脂異常患者血清中代謝產(chǎn)物存在信息的差異。因此，不同血脂水平下檢測血清拉曼光譜特征對于高脂血癥有較高的預(yù)測價值。